抗SPAG9自身抗体在肿瘤患者外周血中表达分析*

任碧琼，李 勇，邹国英，徐国锋，徐 飞

(湖南省第二人民医院检验科，长沙 410007)

众所周知，癌症死亡占疾病死亡首位，成功治疗的关键在于早期诊断，肿瘤标志物的研究一直是热点。人们试图开发抗肿瘤抗原的自身抗体，而不再是瞄准血清抗原作为生物标志[1]，而肿瘤相关抗原多是自身蛋白质往往没有太多的免疫原性[2-4]，如抗CT抗原NY-ESO-1自身抗体在原发性乳腺癌患者中检出率仅占4%[5]，抗CT抗原SCP-1及SSX-2自身抗体分别为6%和1%[6]，所以，需进一步努力鉴别免疫原性肿瘤抗原。近年，国外学者发现精子相关抗原-9(sperm-associated antigen 9,SPAG9)不仅在肿瘤组织表达的阳性率超过80%(蛋白水平和RNA水平)，而且该抗原免疫原性强，能引起肿瘤患者较强的体液免疫反应，产生相应抗体。有报道[12]抗SPAG9抗体在卵巢上皮癌患者血清中的阳性检出率为67%，并在活体内各种组织类型的早期阶段(Ⅰ～Ⅱ期) 表现出高的抗SPAG9免疫活性，而健康人血清中完全没有。另外，有一个较高的SPAG9免疫反应积分的独特模式，与乳腺癌复发显著相关[13]。这些研究为进一步大规模证明肿瘤早期诊断和治疗打下基础。本研究采用SPAG重组蛋白建立ELISA对86例肿瘤患者血清中的SPAG9自身抗体进行检测，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 以2009年7月至2010年9月湖南省第二人民医院肿瘤科的86例肿瘤患者为研究对象，其中，男61例，女25例，年龄(54±11)岁。肺癌37例，肝癌27例，其他癌22例，见表1。健康对照组22例，其中，男14例，女8例，来自湖南省第二人民医院健康体检中心，实验室检查未见任何异常。所有肿瘤均结合病理切片、超声、CT、磁共振、肿瘤标志物等检查确诊。

表1 86例肿瘤患者一般情况

1.2方法

1.2.1标本收集 采集肿瘤患者空腹血3～5 mL，放置20 min，3 000 r/min离心10 min分离血清，-80 ℃冰箱低温保存。健康对照组同样条件采集与保存。

1.2.2SPAG9检测 采用台湾Abnova公司提供的SPAG9重组蛋白作为抗原建立ELISA。包被96孔板，每孔100 ng抗原，体积60 μL，放置4 ℃冰箱过夜；然后取出用洗板机洗板5次，每次1 min；加封闭液每孔200 μL，37 ℃放置2 h；加入稀释后的样本每孔100 μL，37 ℃放置1 h然后再洗板5次，每次1 min。加稀释后的酶标二抗，每孔100 μL，37 ℃放置1 h；再洗板5次，每次1 min；分别加A、B显色液每孔50 μL，37 ℃放置45 min后加终止液50 μL然后在酶标仪上450 nm和620 nm波长比色。参照文献[7]，共检测86例肿瘤患者及22例健康人血清抗SPAG9抗体滴度，本次研究的最佳条件为：SPAG9重组蛋白包被量为每孔100 ng，血清1∶10稀释，酶标仪比色波长450 mm和620 mm。以健康人吸光值均数加2倍标准差作为阳性判断标准。

1.3统计学处理 采用SPSS11.5软件进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各肿瘤患者组及对照组检测情况 86例肿瘤患者血清中SPAG9免疫反应总体阳性率为32.6%，肝癌组阳性率为48.1%，肺癌组为16.2%，其他肿瘤组为40.8%，健康对照组为4.54%。肝癌组及其他肿瘤组与对照组比较差异有统计学意义，见表2、图1。

表2 各肿瘤患者组及对照组检测情况

-：表示此项无数据。

2.2各肿瘤组OD值的分布情况 在肝癌组及其他癌症组患者中OD值比较分散，有较强免疫反应患者；肺癌组患者OD值相对集中，未见强免疫反应患者，见图2。

图1 各组SPAG9免疫反应阳性率

图2 各组OD值分布

3 讨 论

SPAG9是2004年发现的癌-睾丸抗原家族的新成员，作为一种支架蛋白与JNK(c-Jun-NH2-knase)结合，参与JNK信号通路，在细胞的生存、增殖、凋亡和肿瘤的发育等生理过程中扮演重要调节角色[8-9]。SPAG9是一个单拷贝基因定位于人类染色体17q21[9]，这个区域是各种癌症中的一个与癌基因的扩增与表达有关的区域。肿瘤抗原的血清学分析揭示抗原编码在17q21，提示基因编码在17号染色体这一区域增强表达是肿瘤的一个关键事件[10]，所以，SPAG9在活体内的表达特征能作为肿瘤进犯和临床结果的分子标志。

国外一系列研究报道SPAG9在活体内有着很强的体液免疫反应，在卵巢上皮癌中占67%[11]，乳腺癌中占80%[12]，肾癌中77%[13]，子宫颈癌中80%[14]，甲状腺癌中78%[15]，而慢性粒细胞白血病中高达88%[16]，由此可以推导，SPAG9是免疫原性肿瘤抗原，其自身抗体有望成为很好的肿瘤早期诊断指标。

作者的初步研究显示，在86份肿瘤患者血液标本中有28例表现出SPAG9体液免疫反应性，总敏感度为32.6%，其中肺癌的敏感度为16.2%，肝癌为48.1%，其他癌为40.9%；22例对照组中只有1例阳性；特异性为95.5%。虽然本研究的SPAG9自身抗体的阳性率(即敏感度)低于文献报道，但已能初步了解到肿瘤患者外周血中抗SPAG9自身抗体的表达远远高于健康人，并且肝癌患者的体液免疫反应较强，至今尚未发现国内外文献报道。肠道、女性相关的肿瘤也表现出较强的免疫反应，相比之下肺癌的免疫反应较弱，这可能与肺部组织的结构特点有关，也可能是入组患者经过各种治疗效果良好、疾病得到有效控制的缘故。同时作者所采用的ELISA方法的特异性达到95.5%，出现假阳性概率仅为4.5%，说明实验方法特异性较好。但是，若要得到更加理想的实验结果有必要重新收集初诊、未经任何治疗的患者标本进一步研究。总的来说，本研究抗SPAG9自身抗体的阳性率低于国外文献报道的原因可能有如下几方面：(1)因为研究对象大多数为已经过放疗、化疗或者陀螺刀治疗的患者而不是肿瘤初诊患者，诸多的治疗因素干扰研究结果，这也提示SPAG9与肿瘤细胞存活的关系很值得研究；(2)ELISA的条件有待优化，抗原包被量以及标本稀释比例有待进一步摸索。另外，需扩大肿瘤患者病例样本数，严格的分期分级，并同时扩大健康对照样本数进行检测。本研究初步证实SPAG9的免疫原性，发现抗SPAG9自身抗体在各种肿瘤患者外周血中有不同程度的表达，尤其在肝脏肿瘤患者的血清中检出较高的阳性率，值得进一步研究。

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