SDF-1/RUNX1融合蛋白介导的间充质干细胞对造血干细胞增殖和趋化作用的研究*

罗红春，张红宾，秦 波，汪嘉莉，刘 倩

(重庆医科大学附属第一医院：1.感染科；2.血液科 400016；3.重庆市渝北区人民医院消化内科 401120)

骨髓移植是治疗血液病、实体瘤、免疫系统疾病、急性放射病等疾病的有效方法之一，但移植后的造血重建问题一直是临床工作的难点。研究发现基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4生物轴对造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的归巢和植入起到了重要的作用。另外，RUNX1基因作为一种造血细胞分化早期的关键调控因子，对HSCs自我更新与分化间的平衡起着调节作用[1-2]。目前，本课题组已经成功构建pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒载体。在本实验中，作者将转染pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒载体入间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，并检测SDF-1/RUNX1融合蛋白介导的MSCs对HSCs增殖和趋化能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人脐带标本和脐带血标本，由本院妇产科志愿者产妇提供(均系采自健康男性新生儿胎盘的脐血，其孕母排除病毒性肝炎、艾滋病、梅毒等感染)。

1.2试剂 采用Mesencult培养液(Stem Cell公司)；DMED培养基(上海佳和科技生物有限公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(天津生物技术研究所)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CD29、CD13、CD44、CD34、CD31抗体(BD公司)；RUNX1 ELISA试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司)；SDF-1 ELISA试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司)。

1.3脐带源性MSCs的体外培养及生物学鉴定 标本于采集后6 h内，进行间充质干细胞的分离：将脐带剪碎成约1 mm3的小块后用D-Hanks液冲洗，先后经0.1%胶原酶Ⅱ、0.25%胰酶各消化30 min,收集悬浮细胞，接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的Mesencult′培养液，置于37 ℃、5 % CO2、饱和湿度培养箱培养，4～5 d后全量换液,弃去非贴壁细胞,此后每3～4 d半量换液，观察细胞至80%融合时，用0.25%胰酶和1 mmol/L EDTA消化,按1∶3传代。贴壁细胞常规消化后，以CD29、CD13、CD44、CD34、CD31抗体孵育。流式细胞术测定细胞纯度。

1.4人脐血源性CD34+干细胞的体外培养及生物学鉴定 无菌条件下取足月妊娠、正常分娩的新鲜脐血(内加抗凝剂)，标本于采集后6 h内分离。按1∶1体积比加入D-Hanks液稀释，以Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心，1 500 r/min离心15 min。吸取血浆层和分离液层之间的白色云雾状有核细胞层，以低糖DMED培养液洗涤备用。应用MACS免疫磁珠激活分选系统分离CD34+细胞，过分选柱2次以提高纯度，以流式细胞术测定CD34+细胞纯度。

1.5重组腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP对人脐带源性MSCs转染效率的测定 分别用感染指数(moi)为25、50、100、200的重组腺病毒感染NIH3T3细胞。NIH3T3细胞接种于24孔板，密度为2×106个/毫升，以DMED培养液作为阴性对照。1 h后吸弃病毒液，加入培养液。此后每12 h在荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况。为后续试验选择最佳的moi。MSCs培养至第3代时，调整密度为2×105个/毫升，加入24孔板中，培养24 h后，选择最佳moi的重组腺病毒感染入MSCs。荧光显微镜下观察感染后1、3、7、14 d的感染效率。ELISA方法检测重组腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP感染MSCs后 SDF-1和RUNX1的表达。

1.6检测含重组腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP的人脐带源性MSCs对人脐血源性CD34+干细胞的扩增作用 调整CD34+干细胞的密度为2×104个/毫升。制备MSCs细胞滋养层；CD34+细胞种植于有滋养层的 24孔板中培养，隔日半量换液1次。按照实验目的分3组，A1组：CD34+干细胞；B1组：CD34+干细胞和MSCs；C1组：CD34+干细胞和基因修饰后的MSCs。每组均设3个复孔。培养第1、3、7、14天检测CD34+干细胞的扩增倍数。

1.8统计学处理 运用SPSS17.0软件进行数据处理，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1人脐带源性MSCs的培养及鉴定 人脐带源性MSCs长势良好，呈辐射状或涡旋状排列。流式细胞仪检测培养第3代的MSCs的表面标记物CD29的阳性率为99.83%，CD13的阳性率为98.12%，CD44的阳性率为98.89%；不表达CD34、CD31。

2.2人脐血源性CD34+干细胞的纯化及鉴定 经2次过分选柱，每个标本收集CD34+细胞数范围为(2.6～5)×106，0.4%台盼蓝染色计数活细胞率均大于96%。流式细胞仪检测2次分选后CD34+细胞纯度在98.30%以上。

2.3重组腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP感染人脐带源性MSCs的效率 当重组腺病毒感染的moi为50 pfu/细胞时，转染效率最高，可达90%以上。以moi为50 pfu/细胞的重组腺病毒感染MSCs后1、3、7、14 d的转染效率分别为(28.42±8.15)%、(80.58±9.05)%、(68.77±6.27)%、(21.34±7.29)%，见封2图1。ELISA方法检测出重组腺病毒感染MSCs后3 d SDF-1和RUNX1的表达最高。感染后7 d，SDF-1和RUNX1的表达仍然较高(表1)。感染后14 d时，还有少量SDF-1和RUNX1表达。

表1 重组腺病毒感染人脐带源性MSCs后SDF-1和RUNX1的表达

2.4感染重组腺病毒的人脐带源性MSCs对人脐血源性CD34+干细胞的扩增作用 按照1.6中的分组，培养第1天，3组中CD34+干细胞的扩增倍数比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养第3、7、14天，B1组、C1组较A1组CD34+干细胞显著扩增(P<0.05)。培养第7、14天，B1组中CD34+干细胞的扩增倍数显著高于C1组(P<0.05)，见表2。

表2 感染重组腺病毒的人脐带源性MSCs对人脐血源性CD34+干细胞的扩增倍数

2.5感染重组腺病毒的人脐带源性MSCs对人脐血源性CD34+干细胞的趋化作用 按照1.7中的分组，共培养24 h后，Transwell检测CD34+干细胞的迁移指数分别是：A2组(302±8)，B2组(435±20)，C2组(612±18)。B2和C2组的迁移指数明显高于A2组(P<0.05)，并且C2组的迁移指数明显高于B2组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

干细胞移植后的造血重建过程是一个多阶段、多因素的过程，其中造血微环境(Niche)的修复，影响着归巢造血干细胞HSCs的自我更新、增殖和分化，对于机体重建造血功能具有重要意义[3-6]。但移植后HSCs归巢率低且自我增殖能力有限，成为制约骨髓重建的瓶颈问题。

MSCs作为造血微环境主要细胞成分的前体细胞，在造血调控中发挥重要作用。MSCs分化产生的多种骨髓基质细胞，表达多种基质分子，通过细胞-细胞间接触和分泌多种促造血细胞因子支持造血，MSCs还诱导归巢受体、分泌基质细胞衍生因子促使HSCs归巢到骨髓[7-8]，对HSCs保持干细胞特性和造血干细胞归巢具有重要的支持和趋化作用[9-10]。有报道MSCs与HSCs联合移植可促进HSCs的植活率，缩短无髓期，减少死亡率。因此，有必要在移植中充分考虑MSCs的因素[11-12]。

研究发现SDF-1/CXCR4生物轴对HSCs的归巢和植入起到了重要的调节作用[12]。内皮细胞、成骨细胞和其他基质细胞均表达SDF-1，而HSCs表达CXCR4。内皮细胞表达的SDF-1通过E-和P-选择素介导HSCs的跨内皮迁移。作者在前期试验中发现，体内刺激因子较多，可导致HSCs过度分化，使HSCs自我更新能力下降。所以，应更多地关注干细胞干性的保持问题。RUNX1基因作为一种造血细胞分化早期的关键调控因子，即为一个较佳的选择。

作者成功分离培养出人脐带源性MSCs和人脐血源性CD34+干细胞，且具有较高的纯度。利用前期构建的pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒转染入脐带源性MSCs，经检测转染后第3天，转染效率可高达(80.58±9.05)%。第7天时，转染效率仍可达(68.77±6.27)%，虽有所下降，二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。同样，作者用ELISA检测出重组腺病毒感染人脐带源性MSCs后SDF-1和RUNX1的表达也是第3天最高，第7天时仍有较高表达。

在CD34+干细胞的扩增试验中，感染了重组腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP的MSCs可促进CD34+干细胞的增殖，但其扩增程度远不及未感染重组腺病毒的MSCs。由此说明，该重组腺病毒既有利于扩增CD34+干细胞，且又不至于让CD34+干细胞过度的增殖分化。在Transwell趋化试验中，感染了重组腺病毒的MSCs和未感染重组腺病毒的MSCs均可显著促进CD34+干细胞的迁移，且前者的趋化作用高于后者(P<0.05)。由此说明，该重组腺病毒转染MSCs后，有明显的诱导CD34+干细胞归巢的作用。

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