4种支架构建复合式口腔黏膜的组织学特点＊

刘加荣， JW Von den Hoff，AM Kuijpers－Jagtman， 陈莉莉

1 华中科技大学同济医学院附属协和医院口腔科，武汉 430022

2 荷兰Radboud大学医学中心，正畸与颅面生物系，PO Box 9101，6500HB Nijmegen

唇、腭裂，口腔肿瘤切除，牙周手术后，均存在黏膜不足，口腔黏膜自身供给有限，而在口腔中应用皮肤修复又有很多缺点，如：皮肤的角化层在口腔黏膜的湿润环境中容易感染真菌，另一个缺点是汗毛的生长［1］。为解决自身口腔黏膜不足的问题，减少瘢痕形成，组织工程替代物研究已成为当前口腔黏膜工程学的重要课题，理想的支架材料与细胞的结合是口腔黏膜组织工程的关键［2］。本研究运用4种生物支架材料——脱细胞真皮基质材料（de－epidermised dermis，DED）、Alloderm（商品化脱细胞真皮基质）、胶原凝胶和胶原海绵－胶原凝胶复合物，构建双层、有活性的人工口腔黏膜，检测其结构，比较4种材料在构建组织工程化口腔黏膜方面的优劣。

1 材料和方法

1.1 主要试剂材料

DMEM 培养液，胎牛血清（FBS），青链霉素（1／1 000U），胰蛋白酶，Dispase Ⅱ，Ⅰ型胶原酶，角化细胞培养液Keratinocyte－SFM，EDTA，表皮生长因子（EGF），以上均为美国Gibco公司产品。胶原海绵（自制），Ⅰ型胶原（Sigma 公司），Alloderm（Life－cel1公司）。

1.2 口腔黏膜成纤维细胞及角质形成细胞的分离培养

细胞来源为助萌术或智齿拔除时切除的人正常口腔黏膜组织。标本经含双抗的PBS冲洗，0.25%中性蛋白酶Dispase Ⅱ4℃消化16～18h，将表层上皮与上皮下层用眼科镊分开。上皮层加入0.025%胰蛋白酶－0.05% EDTA 37℃消化10 min后，加入胎牛血清中止消化，吸管吹打成单细胞悬液，过200目不锈钢滤器，收集细胞的悬液经离心后弃上清，在所获细胞中加入角化细胞培养液，接种，置细胞培养箱中培养，每3 天换液。细胞生长至70%～80%融合时传代。

将分离后的上皮下层剪碎，加入0.25%Ⅰ型胶原酶消化2.5h，离心，去上清，在获得的成纤维细胞中加入含10%FBS的DMEM 后培养，每3天换液。细胞生长至70%～80%融合时传代。本实验选用增殖能力较强的2～3代上皮细胞。

1.3 以DED和Alloderm 为基质的复合式口腔黏膜的建立

1.3.1 DED 的制备 将美容手术后取下的皮肤放在50mL的离心管中，无菌操作台中经PBS冲洗3次。将皮肤放在肾形盒中，倒入液氮。当温度升至室温时，反复倒入液氮2次。将皮肤转入至无菌培养皿中，加入含有抗生素的PBS，37℃放置7～14d，每隔1天换1次PBS。用镊子去掉真皮表面的表皮后，将基质放在PBS中继续放置10～14d，每隔5～7天换液。将脱细胞基质切成合适小块，放在无菌离心管中－70℃保存。

1.3.2 以DED 和Alloderm 为基质构建复合式口腔黏膜 利用离心的方法将成纤维细胞加入至DED 及Alloderm 中［3］。在15mL的离心管中加入10mL 1% 的琼脂糖溶液，待琼脂糖冷却后用DMEM 冲洗，加入1 mL 的成纤维细胞培养液，室温下放置1h。将DED 及Alloderm 放在管内的琼脂糖上，基底膜面朝下，在管中加入1mL 含有2.0×105的成纤维细胞混悬液，45g 离心1h。离心后，计数液体内剩余的成纤维细胞，以计算细胞加入基质中的效率。

离心后，在含有成纤维细胞的基质中加入含10%FBS的DMEM 培养液，培养1周。将DED 及Alloderm 翻转，基底膜面朝上，在基质膜的表面放置不锈钢圈（钢圈的内直径为1cm），加入1mL 含有2.0×105的角质形成细胞悬液，过夜后，移走不锈钢圈。继续培养3d后，将人工黏膜移至气液面，继续培养7d，以促进表皮细胞的角化。

1.4 以胶原凝胶为基质的复合式口腔黏膜的建立

调整成纤维细胞密度至2.0×105／mL；取胶原蛋白与10×DMEM 以8∶1比例混匀（冰浴），利用l mol／L NaOH 调pH 至7.4，立即加入l份成纤维细胞悬液，快速混匀，置培养箱待胶原凝固后，加入含有10%FBS的DMEM 中培养7d，将标本置于支架上，以2.0×105／mL 密度在胶原凝胶表面种植角质形成细胞，浸没培养4d，移至气液面，继续培养1周。

1.5 胶原海绵－胶原凝胶的制备及复合式口腔黏膜的建立

将制备好的胶原海绵剪成边长约为1cm 的正方形，胶原凝胶的制备方法同1.4项，将含有成纤维细胞悬液的胶原凝胶缓慢加入至胶原海绵中，待凝胶凝固后加入培养液，培养至第7天，以2.0×105／mL的密度将角质形成细胞接种在胶原海绵－胶原凝胶的表面，浸没培养4d，移至气液面，培养1周，隔日换液1次。

1.6 复合式口腔黏膜的组织形态学观察

将培养的组织工程化黏膜以10%的中性甲醛固定，包埋，切片，苏木精－伊红染色后，光镜下观察。

2 结果

2.1 口腔黏膜成纤维细胞及角质形成细胞的培养

成纤维细胞贴壁生长，呈长梭形（图1A），融合生长的成纤维细胞排列成旋涡状。利用消化法获得的角质形成细胞长出率高，长出时间短，融合时间较快。细胞较大，呈不规则多边形，轮廓清晰，细胞融合后，排列紧密，呈典型铺路石样外观（图1B）。

2.2 成纤维细胞的加入效率

成纤维细胞通过离心加入至DED 和Alloderm中的效率在60%～70%之间，然而成纤维细胞在DED 和Alloderm 中的分布是不均一的。如图2所示，大多数细胞都分布在DED 和Alloderm 的网状层一侧，只有少数成纤维细胞深入至基质深层。

图1 分离培养的成纤维细胞（A）和角质形成细胞（B）（×200）Fig.1 Cultured fibroblasts（A）and keratinocytes（B）from oral mucosa（×200）

图2 成纤维细胞离心加入DED和Alloderm 中的效率Fig.2 The adding efficacy of fibroblasts into DED and Alloderm

2.3 复合式口腔黏膜的组织形态学比较

角质形成细胞在Alloderm 和DED 上面均形成分化良好的上皮（图3A、B）。上皮大约由4～8 层细胞构成，与自然口腔黏膜相比，人工黏膜的角化层厚得多，也较疏松。二者的不同之处在于复层上皮细胞与Alloderm 结合并不紧密，中间出现了很多小的缝隙，上皮钉突不够明显（图3A）。而上皮与DED 结合紧密，形成的人工黏膜有明显的上皮钉突（图3B）。

以胶原凝胶为基质形成的人工口腔黏膜较厚，有7～8层细胞，形成类似正常黏膜上皮层样的明显各层细胞形态，但是无上皮钉突的形成（图3C）。以胶原海绵－胶原凝胶为基质形成的人工口腔黏膜，上皮层厚度4～8层，表面有明显的角化层，无上皮钉突形成，在部分区域，胶原海绵中未被胶原凝胶占据的空隙中有角质形成细胞的长入（图3D）。

图3 以4种支架材料为基底构建的人工口腔黏膜形态Fig.3 Morphology of cultured mucosa equivalents on 4different scaffolds

3 讨论

将成纤维细胞接种入组织工程黏膜中，可分泌细胞外基质及多种细胞活性因子来促进角质形成细胞的生长增殖，同时可改善、重建真皮成分的构成。在本研究中，成纤维细胞是利用离心方法加入至DED 和Alloderm 中的［3］，然而在我们的研究中，成纤维细胞在脱细胞基质中的分布并不是均一的。大多数细胞都分布在脱细胞基质中的网状层面，也就是离心端。这与以前非离心方法获得的结果类似［4］。离心方法能够增加成纤维细胞的加入效率，然而脱细胞基质中的胶原纤维妨碍了细胞进入基质的深层。

本实验分别采用的4 种不同支架材料：Alloderm、DED、胶原凝胶、胶原海绵－胶原凝胶在体外构建了组织工程化口腔黏膜样组织。然而，不同材料所构建的黏膜组织仍有不同。

脱细胞真皮基质以美容切除皮肤为原料，经脱细胞处理去除了表皮层和真皮内可诱发宿主排斥反应的细胞成分，而保留了近似正常形态结构的真皮支架，有利于角质形成细胞和成纤维细胞的黏附生长。具有抗原性弱，生物相容性好，血管化速度快，可诱导自体组织细胞再生及减少瘢痕形成等优点。以Alloderm 和DED 为支架材料构建的组织工程化口腔黏膜，上皮层均分化良好，结构与天然口腔黏膜类似。本研究中上皮层与DED 结合更加紧密，并形成了上皮钉突。上皮层与Alloderm 结合不紧密，出现小的缝隙，这与以往的报道不同。可能是因为商品化的Alloderm 在储存和转运中基底膜成分受损，而不利于表皮细胞黏附增殖。而DED 因新鲜制备而其基底膜成分完整，所以形成的结构更近似于正常口腔黏膜。

胶原作为结缔组织中的主要支持成分，因其来源广泛，抗原性较弱，利于细胞的生长和基质的沉积、血管再生及上皮细胞附着，而在组织工程支架中应用广泛。在本实验中以胶原凝胶为支架构成的组织工程口腔黏膜上皮层最厚，可能是因为胶原凝胶为成纤维细胞和角质形成细胞提供了直接接触，成纤维细胞分泌的多种细胞外基质及细胞因子可促进角质形成细胞的生长增殖，所以胶原凝胶支架为研究成纤维细胞与角质形成细胞之间相互作用提供了理想的模型。但是由于单纯的胶原凝胶脆性大，不易操作，很难将复合培养物整体转移，限制了其临床应用价值。利用多孔的胶原海绵载体中加入胶原凝胶可为胶原基质提供可操作性，但在实验中，很难保证胶原海绵所有的空隙都能被胶原凝胶充满，也就很难避免上皮层长入基质中，以往的报道中也出现类似现象［5］。

所有人工黏膜的角化层比正常黏膜都厚，我们认为这是因为在培养中缺乏机械摩擦力所致。在人工皮肤中也出现类似现象［6］。

综上所述，我们认为DED 是4种材料中最理想的支架，形成的上皮类似于正常口腔黏膜，可操作性良好。胶原凝胶支架可作为研究成纤维细胞与角质形成细胞相互作用模型的支架材料。

［1］ Liu J，Bian Z，Kuijpers－Jagtman A M，et al.Skin and oral mucosa equivalents：construction and performance［J］.Orthod Craniofac Res，2010，13（1）：11－20.

［2］ Liu J，Mao J，Chen L.Epithelial－mesenchymal interactions as a working concept for oral mucosa regeneration［J］.Tissue Eng Part B Rev，2011，17（1）：25－31.

［3］ El Ghalbzouri A，Lamme E，Ponec M.Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis［J］.Cell Tissue Res，2002，310（2）：189－199.

［4］ Erdag G，Sheridan R L.Fibroblasts improve performance of cultured composite skin substitutes on athymic mice［J］.Burns，2004，30（4）：322－328.

［5］ Moriyama T，Asahina I，Ishii M，et al.Development of composite cultured oral mucosa utilizing collagen sponge matrix and contracted collagen gel：apreliminary study for clinical applications［J］.Tissue Eng，2001，7（4）：415－427.

［6］ Lee D Y，Ahn H T，Cho K H.A new skin equivalent model：dermal substrate that combines de－epidermized dermis with fibroblast－populated collagen matrix［J］.J Dermatol Sci，2000，23（2）：132－137.