柱前衍生超高效液相色谱法测定核桃仁中的氨基酸含量*

杨俊，王文辉，李翼，王齐，孙晓东，朱艳琴

(昆明理工大学分析测试研究中心，云南省分析测试中心，云南昆明，650093)

柱前衍生超高效液相色谱法测定核桃仁中的氨基酸含量*

杨俊，王文辉，李翼，王齐，孙晓东，朱艳琴

(昆明理工大学分析测试研究中心，云南省分析测试中心，云南昆明，650093)

建立超高效液相色谱法(UPLC)测定核桃仁中氨基酸的含量。文中采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，AccQ.Tag Ultraa Eluent A及AccQ.Tag Ultraa Eluent B梯度洗脱，流速为0.7 mL/min，波长248 nm，柱温55℃。结果显示:17种氨基酸在0.003～0.18 mg/mL内有良好的线性关系(r＞0.999 4)，平均回收率(n=6)为98.5%。该方法10 min内17种氨基酸能够完全分离，具有快速、准确、重复性好的特点。

超高效液相色谱(UPLC)，氨基酸，核桃仁，含量测定

核桃(Juglans sigillata Dode)，又名胡桃、羌桃，为胡桃科胡桃属落叶乔木的果实。其果仁(核桃仁)营养丰富，含有丰富的蛋白质、脂肪，矿物质和维生素。核桃仁中含有18种重要的氨基酸，其中，人体必需氨基酸检测出8种，即苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸［1］。我国核桃年产量为50万t，占世界核桃产的30%以上，是世界核桃第一产量大国，因此可以说，核桃是中国重要的植物优质蛋白源。

超高效液相色谱(UPLC)技术是近年来发展较快的新型液相色谱检测技术，由于采用了1.7 μm颗粒度的色谱柱填料，因此能够获得更高的柱效，并且在更宽的线速度范围内柱效保持恒定，有利于提高流动相流速、缩短分析时间和提高分析通量。相对于传统的高效液相色谱法(HPLC)而言，UPLC具有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度，为复杂体系的分离分析提供了良好的技术平台。

目前应用于氨基酸分析的主要方法有柱后衍生高效阴离子交换色谱法［2］、柱前衍生反相高效液相色谱法［3］、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法［4］，以上这些方法的分析时间都需要45～120 min，分析时间较长［5］，本文采用柱前衍生UPLC法测定核桃中的氨基酸含量，对测定条件进行优化，比常规HPLC法省时30～40 min，且灵敏度高，准确性好，是一种简便、快速、准确的检测方法.

1 仪器和试剂

美国Waters ACQUITY Ultra Performance LC系统，ACQUITY UPLC(r)紫外检测器，Waters Empower 2色谱数据工作站，17种氨基酸水解标准溶液(美国Waters公司提供)，AccQ.Tag Ultra Eluent A(醋酸盐缓冲溶液 pH=5.2，美国 Waters公司提供)，AccQ.Tag Ultraa Eluent B(60%乙腈，美国Waters公司提供)，Waters AccQ-Fluor试剂盒［包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A(6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯)、稀释液2B(乙腈)，美国Waters公司提供］，乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)。

水为超纯水，核桃(购自昆明金马正昌果品批发市场)。

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm ×100 mm，1.7μm);紫外检测波长:248 nm;柱温55℃;梯度洗脱见表1。理论塔板数以谷氨酸不低于5 000。

表1 梯度洗脱

2.2 氨基酸标准使用液的制备

取1支Waters氨基酸标准水解溶液，打开后吸取1 mL，放至一支干净的25 mL试管中，加9.0 mL超纯水，旋涡混匀备用。浓度见表2所示。

2.3 衍生试剂制备

将烘箱预热至(55±1)℃，取一瓶衍生剂粉2A，轻轻敲动以确保打开前所有粉在瓶底，吸取1 mL稀释液2B并弃去以冲洗一个干净的微量移液吸头，移1 mL稀释液2B至2A瓶中，盖紧瓶盖，旋涡混匀10 s，55℃加热5～10 min使衍生剂粉溶解(加热不得超过10 min)。将溶解后的衍生试剂放入干燥器中，可在室温保存1 w。

表2 氨基酸使用液浓度

2.4 氨基酸标准使用液的衍生

将烘箱预热至(55±1)℃;用微量进样器吸取10 μL氨基酸标准使用液至一支干净的样品管底部，移70 μL硼酸缓冲液至样品管中，短暂旋涡混匀，移20 μL衍生试剂至样品管中，立即旋涡混匀数秒种，室温放置1 min;用封口膜封口，55℃加热5 min即可。

2.5 样品溶液的制备

精密称取经室温自然晾干并粉碎均匀的核桃仁粉约50 mg，置干燥洁净的安瓿瓶中，加2 mg苯酚(精制)，加6 mol/L HCl溶液2 mL，充氮，迅速将充好N2的安瓿瓶瓶口置于酒精喷灯上封口，置110℃烘箱中水解24 h，打开安瓿瓶，取1 mL水解液移入蒸发皿中，蒸干，残渣用水分次洗涤，合并洗涤液，滤液移至10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.6 样品溶液的衍生

吸取供试品溶液约1 mL，通过0.22 μm微孔滤膜过滤，吸取10 μL滤液按2.4以下同法操作。进样量 1 μL。

3 结果与讨论

3.1 系统适用性试验

将样品溶液及氨基酸标准使用液依次进样，得色谱图(图1)，从图1中可看出，17种氨基酸完全分离。

图1 氨基酸标准品(A)和核桃仁样品(B)UPLC色谱图

3.2 线性关系考察

精密吸取对照品溶液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μL按“2.1”项下色谱条件进样进样，测定，以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积的为纵坐标(Y)绘制标准曲线。详见表3。

表3 氨基酸的检出限及线性范围

3.3 稳定性试验

取所制备的17种氨基酸溶液，分别在0、6、12、24、36、48 h测定各氨基酸的峰面积，计算各氨基酸峰面积的RSD为1.12% ～1.26%。结果表明，供试品溶液在48 h内稳定。

3.4 重复性试验

取同一样品按2.5方法制备6份样品溶液，分别进样，测定17种氨基酸峰面积，计算含量，RSD为1.0% ～1.2%。

3.5 回收率试验

精密称取已测知含量的核桃仁样品25 mg，共6份，分别精密加入17种氨基酸水解标准溶液0.5 mL，按2.5方法制备供试液并测定，计算平均回收率为98.5%，平均RSD=2.1% 。详见表4。

3.6 样品含量测定

采用2.5方法，对不同的核桃仁样品进行处理，用2.1色谱方法进行测定，各样品中的氨基酸的含量测定结果见表5。同时用国家标准方法(GB/T 5009.124－2003食品中氨基酸的测定)做对照实验，表6为采用UPLC法和国家标准方法的结果比较。从表6可以看出UPLC法和国家标准方法得到的氨基酸的含量基本一致，证明本方法可靠性较好。

表4 17种氨基酸的回收率

表5 核桃仁中氨基酸的测定结果

表6 采用UPLC法和国家标准方法的结果比较

4 结论

本实验采用柱前衍生UPLC法对核桃仁样品中的17种氨基酸的含量进行测定，10 min内17种氨基酸能够完全分离。比常规的HPLC法缩短了30～40 min，方法的准确度和精密度均较高。结果证明，UPLC法具有快速、高分离度等优势，将UPLC法替代HPLC法测定核桃仁中氨基酸含量，准确、快速，灵敏能提高色谱峰分离度，大大减少分析时间，提高工作效率，减少溶剂损耗及废液处置费用，适用于核桃仁中氨基酸的快速测定。

［1］ 郝艳宾，王克建，王淑兰，庄艳玲.几种早实核桃坚果中蛋白质、脂肪酸组成成分分析［J］.食品科学，2002，23(10):123－125.

［2］ 墨淑敏;梁立娜;蔡亚岐;牟世芬;温美娟.高效阴离子交换色谱-电化学法测定酱油中的氨基酸［J］.分析试验室，2006(5):36－39.

［3］ 程显隆;肖新月;邹秦文;李广华;田守生.柱前衍生化HPLC法同时测定阿胶中4种主要氨基酸的含量［J］.药物分析杂志，2008(12):1 997 －2 000.

［4］ 于泓;丁永胜;牟世芬.阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法分离测定氨基酸注射液中的氨基酸和葡萄糖［J］.分析化学，2002(5):398 －402.

［5］ 于泓，牟世芬.氨基酸分析方法的研究进展.［J］分析化学，2005，33(3):398 －404.

Determination of Amino Acids in Walnuts by Ultra Pefformanace Liquid Chromogray(UPLC)with Pre-column Derivation

Yang Jun，Wang Wen-hui，Li Yi，Wang Qi，Sun Xiao-dong，Zhu Yan-qin
(Research Center for Analysis and Measurement，Kuming University of Science and Technology，Kunming 650093，China)(Analytic and Testing Reseach Center of Yunnan，Kunming 650093，China)

To establish an UPLC method in determination the amounts of Amino Acids in Walnuts.A Waters Acquity UPLC BEH C18 column(2.1 mm ×150 mm，1.7μm)was applied，using AccQ.Tag Ultraa eluent A and AccQ.Tag Ultraa eluent B as the mobile phase，with a flow rate of 0.7 mL/min，and the column temperature 55℃.The calibration curve was linear in the range of 0.003～0.18 mg/mL of Amino Acids(r＞0.999 4).The average recovery of Amino Acids was 98.5%.It has the advantage of simple，accuracy，and repeatable in the determination Amino Acids.

ultra performance liquid(UPLC)，amino acids，kernel of walnut，quantitative analysis

学士，工程师。

2010－03－30，改回日期:2010－12－01