影响电穿孔法转化效率的因素

张小娟(综述)，张荣光(审校)

(1.河南科技大学医学院病原生物学教研室，河南洛阳471003;2.郑州大学河南省分子医学重点学科开放实验室，郑州450001)

电穿孔转化细胞的方法是分子生物学中常用的技术，广泛应用于基因克隆、外源基因的表达、基因定位、基因图谱的绘制等研究［1-3］。虽然基因转移可以通过化学的方法实现，但是操作复杂且效率低。经典的氯化钙转化法转化效率较低;病毒转染的方法虽然效率很高，但是对健康的威胁不可忽视;电穿孔基因转移法适用范围广，转化效率高，残余毒性小［4］，是最有发展潜力的一种转化方法。然而，由于影响电穿孔方法的因素较为复杂，其中一些技术环节的机制并不十分清楚，转化效果的稳定性难以保证，这在一定程度上制约了该方法的推广应用。近年来，随着国内外对该方法应用实践的增加，人类对影响电穿孔法转化效率的因素有了更深入的认识。现对影响电穿孔法转化效率的因素进行综述。

1 感受态细胞

1.1 细菌浓度 李南等［5］在优化大肠埃希菌TG1电转化条件时，将细菌悬液按1∶10梯度稀释，取等体积不同浓度的菌液进行电穿孔。结果发现，在一定规范内，细菌浓度越高，转化效率就越高，两者呈正相关，菌浓度为1010个/mL时，转化效率最高。韦晓明等［6］在探索大肠埃希菌XL1-Blue菌株电转化条件时，分别用2.5×1013、2.5×1014、2.5×1015个/L三个感受态浓度进行电转化，结果表明菌浓度为2.5× 1015个/L时的转化效率较菌浓度为2.5×1014个/L时高10倍，较2.5×1013个/L高16倍。

1.2 细菌生长周期 细菌培养到不同密度都能用于电转化，但最好的转化效率是在对数生长期。电转化效率和细胞存活数均与转化前的细胞所处生长阶段有关。在对数生长期，每个细胞对电击都非常敏感，死亡率较高。但在存活的细胞中，转化子的比例较高(约80%)。

当细胞进入对数后期，细胞存活率上升，转化效率也逐渐下降，因此电转化的细菌以培养到对数中期较为合适［7，8］。在制备感受态时，常通过测定菌液光密度(optical density，OD)值方法判断细菌生长阶段。韦晓明等［6］发现在大肠埃希菌XL1-Blue处于对数生长早期、OD600为0.3～0.4时转化效率达到最高，随着细菌的老化，OD600值每增加0.1，转化效率都会下降一个数量级以上。所以制备电转化用感受态时，应严格掌握菌液的OD值，以保持较高的转化效率。

1.3 细胞培养温度 韩峰等［9］采用大肠埃希菌DH5α菌株研究了细菌培养温度对电转化效率的影响。研究结果显示，在18℃下培养的细菌，当菌液OD600为0.5～1.0时，转化效率都维持在高水平;而在37℃培养的细菌，仅当OD600为0.6～0.7时转化效率出现一个锐利的峰值，菌液OD值偏高或偏低都会使转化效率显著下降。

2 电转化过程

2.1 电场强度 电场强度是影响电转化效率的主要因素。在一定范围内，随着电场强度的增加，外源DNA越容易进入细胞，但细胞的死亡率也会随着电场强度的增加而增加。所以要得到最高的电转化效率，一方面要提高电场强度到一个合适数值，另一方面又要尽量降低死亡率。戴建新等［10］研究了电场强度对电转化效率的影响。结果表明在低电场强度(1～10 kV/cm)作用下，转化效率＜109CFU/μg DNA;而当电场强度＞10 kV/cm时，转化效率显著上升，并在12.5～15 kV/cm时，转化效率达到峰值(约2× 109CFU/μg);当电场强度继续升高时，转化效率则迅速下降。

2.2 脉冲时间 研究表明，电脉冲时间对电转化效率有较大影响，时间太短或太长均会使转化效率降低。目前，脉冲时程阈值现象还不能作出理论计算，但其合理的解释为:一方面，因为膜电容的充电需要一定的时程，才能使膜电位达到稳定值，这一时程正好是电穿孔导入小分子的阈值;另一方面，只有外电场持续提供能量，保持胞膜穿孔部位局部的无序状态，才能使孔道扩大至细胞骨架网孔的大小。如果脉冲时程过短，则孔道很快自发地复原为有序结构。这可能是采用电穿孔方法导入大分子DNA时，脉冲时程存在阈值的原因。戴建新等［10］在探索大肠埃希菌DH5α电转化影响因素时发现，当电场强度为15 kV/cm时，脉冲持续时间取4～5 ms，其转化效率即达峰值;若脉冲持续时间延长，则转化效率迅速下降。

2.3 电击前后冰浴时间 在进行电转化前，通常不需要把DNA提前加到细胞悬液中。据报道，DNA在进入细胞之前并不需要结合到细胞表面［7，8］，而且在菌液中预先加入的DNA还有可能被感受态细胞分泌的核酸酶的降解。张洋等［11］采用大肠埃希菌DH10B研究了转化前的冰浴时间对转化效率的影响。结果发现，冰浴时间0～30 min对转化效率无显著影响，即DNA分子与细胞表面的结合(或充分靠近)并不是必需的，也可能混合完全后的质粒DNA和感受态细胞已经完成了结合过程(或距离已经充分接近)。韩峰等［9］也证实电击前将感受态细胞在冰上静置0～30 min对转化效率影响不大，在最初的5 min内转化效率稍有提高，但随后的25 min内则呈下降趋势。电击后在加入培养基前的冰浴时间不同(0～30 min)，对转化效率影响显著，在冰浴1 min内转化效率就呈现大幅度下降，10 min后几乎降至最低点，只有不冰浴的20%。

2.4 脉冲信号持续时间 电脉冲信号音响后持续不同时间对转化效率有较大影响。张建琼等［12］的实验结果表明，电脉冲音响后持续2 s较信号音响后即停和信号音响后持续3 s转化效率明显增加。

2.5 样品盐离子成分 如果样品中盐离子浓度过高时，导电能力增强，放电两极之间形成低电阻通路，瞬间电流急剧增加，产生无效放电或旁路放电，不能使菌体胞膜产生孔洞，同时，瞬间强电流导致电击体系温度骤然升高，大量细菌死亡，引起转化效率显著下降，甚至引起电击穿现象，造成实验失败。方勤等［13］研究发现，采用乙醇沉淀法可有效去除连接产物中的盐分，有利于提高转化效率。然而，包其郁等［14］对1 μL各含0.01 ng或0.001 ng pUC18 DNA的1×连接反应混合物进行乙醇沉淀处理后，转化效率反而降低至1/10～1/100，因此认为乙醇沉淀法不能有效地提高转化效率。在微量DNA状态时，由于处理过程中造成DNA的丢失反而使转化效率降低。此外，稀释法、透析法也能有效降低样品盐离子浓度，但稀释法不利于小体积转化的要求;透析法回收率较低。因此，急需研究开发一种纯化回收微量质粒DNA的简便而有效的方法。

2.6 抗生素浓度 李南等［5］在用质粒pFab74X电转化大肠埃希菌TG1时发现，将选择培养基中氨苄青霉素的浓度从100 mg/L降至20 mg/L，可使转化效率上升约5倍。其可能原因是电穿孔后的细胞虽然经过短时间的恢复培养，但仍然比较脆弱，适当降低选择性培养基中抗生素浓度，有利于转化菌的抗性基因的充分表达，可以进一步提高转化效率。韦晓明等［6］在探索大肠埃希菌XL1-Blue电转化条件时，分别用含氨苄青霉素100、50、20 mg/L的培养板筛选转化菌，结果表明，氨苄青霉素浓度为100 mg/L时的转化率是50 mg/L时的1/2，是20 mg/L时的1/3。

2.7 电击温度 电击时产热可直接影响感受态细胞的存活率，因此需要特别注意保持菌液的温度。电转化时样品的开始温度对转化效率影响很大，如大肠埃希菌在0～4℃进行电击的转化效率比在室温下至少提高100倍［8］。

3 质粒大小、用量及构象

3.1 质粒大小 质粒的大小直接影响转化效率。由于需要导入细菌的质粒长度远大于电穿孔所导致的细胞空洞，因此质粒只能沿长轴方向通过扩散导入细胞。短质粒较之长质粒转化率高的原因为:电击后，在细胞孔道重新闭合前的数秒内，短质粒完全进入细胞的数目较长质粒多，进而形成较多的转化菌落;而长质粒来不及完全进入菌体细胞内，致使获得的转化菌落较少［15］。

3.2 质粒用量 电转化时的质粒DNA用量在很大范围内和转化子数呈线形关系。研究表明，电转化大肠埃希菌时，质粒DNA用量在10～7.5 mg/L范围内，转化子数和DNA用量呈线型关系，转化效率可达109个/μg DNA以上［8］。但在相同的转化体积中(细胞数相同)DNA用量愈多，转化子数也愈多，即转化效率(转化子数/存活细胞数)和DNA浓度呈正相关。

3.3 质粒构象 质粒DNA的构象对转化效率的影响非常明显，超螺旋质粒的转化效率远高于线型和开环质粒，因此用于转化的质粒中超螺旋状态DNA分子的比例至少应达到2/3［16］。

文献报道的不同菌株电转化条件不统一，由于菌株细胞壁厚薄、细胞大小及形状等因素影响造成菌株对电转化的耐受性及敏感程度不同，其在电转化时所采用的条件也各不相同。因此，在对新菌株进行电穿孔转化时，有必要探索其最佳转化条件。

4 小结

目前电穿孔技术的应用范围得到不断拓展，例如，将该技术用于核酸疫苗的转递［17，18］;通过质粒或外来基因转染原生动物［19］;非热效应杀灭肿瘤细胞［20］;向正常组织或肿瘤组织中转入治疗性蛋白基因［21，22］;向组织中转入生长因子基因，促进组织再生［23］;基因剔除［24］等。随着国内外对电穿孔技术的研究日益深入，其在生物和医学领域将有着非常广阔的应用前景。

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