鲍曼不动杆菌16SrRNA甲基化酶的研究进展

张利娟(综述)，郝邯生(审校)

(1.天津医科大学研究生院，天津300070;2.中国人民武装警察部队医学院附属医院传染科，天津300162)

鲍曼不动杆菌为条件致病菌，可引起医院内特别是重症监护病房中危重患者的各种感染，包括呼吸机相关性肺炎、皮肤和软组织感染、伤口感染、继发性脑膜炎、血行感染［1］等。鲍曼不动杆菌是院内感染的重要病原菌，在革兰阴性杆菌所致的院内感染中位居前四位［2］，在重症监护病房非发酵菌感染中居第一、二位［3，4］。细菌耐药监测数据显示，鲍曼不动杆菌多重耐药甚至泛耐药菌株正以惊人的速度增加，近年来又出现了 XDR(extreme drug resistance)［5］和超级细菌［6］，并在世界范围内播散，给临床治疗带来巨大挑战。氨基糖苷类抗菌药在治疗严重细菌感染中发挥着重要作用。现就介导革兰阴性菌尤其是鲍曼不动杆菌氨基糖苷类抗菌药耐药的一种新机制16SrRNA甲基化酶综述如下。

1 氨基糖苷类抗菌药及其细菌耐药

氨基糖苷类作为一类高效、广谱、杀菌类药物广泛应用于临床，特别是治疗革兰阴性菌所致的严重感染。该类药物作用于细菌核糖体30S亚基的16SrRNA高度保守的A区，干扰细菌蛋白质的合成，从而引起细菌死亡。根据核糖体作用部位的不同，氨基糖苷类可分为以下几类:①与A位点结合的氨基糖苷类，包括4，6-二取代脱氧链霉胺类。卡那霉素组——阿贝卡星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素;庆大霉素组——庆大霉素、西索霉素、异帕米星、奈替米星。4，5二取代脱氧链霉胺类:如新霉素、巴龙霉素、青紫霉素A、核糖霉素。不同于以上结构的其他氨基糖苷类(如安普霉素)。②非A位点结合的氨基糖苷类，如链霉素、壮观霉素等［7］。细菌对氨基糖苷类耐药主要是产生氨基糖苷类修饰酶。

2003年质粒编码的16SrRNA甲基化酶作为介导高水平氨基糖苷类耐药的新机制出现。迄今为止，7种16SrRNA甲基化酶基因armA［8］、rmtA［9］、rmtB［10］、rmtC［11］、rmtD［12］、rmtE［13］和npmA［7］已经在世界范围的肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌中出现，检出率0.03%～95.00%不等，这种差异取决于细菌的样本量，特别是对氨基糖苷类的耐药水平。此外，不同类型的甲基化酶存在于不同地区不同细菌种属中，rmtA最初发现只存在于日本和韩国铜绿假单胞菌中，rmtD只在拉丁美洲存在，鲍曼不动杆菌仅检测到armA［14］。

2 新的耐药机制——16SrRNA甲基化酶的发现

16SrRNA甲基化酶原本是抗生素产生菌(如链霉菌属和小单孢菌属)为免于被自身产生的抗生素杀灭，在S-腺苷甲硫氨酸协同下对rRNA的转录后甲基化，是一种自我保护机制，曾被认为没有临床意义［15］。2003年，Galimand等［8］从泌尿系统分离的多重耐药肺炎克雷伯菌中发现了16SrRNA甲基化酶armA，这是首次在临床菌株中发现编码该类酶的基因，该菌对4，6二取代脱氧链霉胺类耐药，对安普霉素、巴龙霉素、链霉素敏感。Yokoyama等［9］从铜绿假单胞菌AR-2中发现了16SrRNA甲基化酶rmtA，该菌对庆大霉素组、卡那霉素组及新霉素高水平耐药［最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)＞1024 mg/L］，对链霉素敏感。2004年，Doi等［10］从黏质沙雷菌S-95中发现了rmtB，该菌对庆大霉素组和卡那霉素组高水平耐药，对新霉素和潮霉素B敏感。2006年，Wachino等［11］从奇异变形杆菌中发现rmtC，该菌对庆大霉素组和卡那霉素组高水平耐药(MIC＞1024 mg/L)，但对新霉素和链霉素敏感。2007年Doi等［12］从铜绿假单胞菌PA0905中分离出rmtD，该菌对阿贝卡星、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素的MIC值均高于256 mg/L，对安普霉素、新霉素和链霉素敏感。Wachino等［7］在多重耐氨基糖苷类的大肠埃希菌ARS3中分离出npmA，介导对卡那霉素组、庆大霉素组、新霉素、核糖霉素、阿普霉素、壮观霉素耐药(MIC＞256 mg/L)。2010年 Davis等［13］从牛分离出的耐庆大霉素和阿米卡星的大肠埃希菌中发现了rmtE。至此，7种16SrRNA甲基化酶介导对多种氨基糖苷类高水平耐药基因被发现。鲍曼不动杆菌携带16SrRNA甲基化酶armA最早在韩国［16］发现，随后北美［17］、中国大陆地区［18］也相继报道。目前在鲍曼不动杆菌中尚未发现其他编码16SrRNA甲基化酶的基因型。

3 16SrRNA甲基化酶介导的氨基糖苷类耐药机制

氨基糖苷类抗菌药通过与细菌核糖体30S亚基16SrRNA上A位点的一个高度保守基元结合(该结构由A1408·A1492碱基对和1492位点的腺苷突起组成的不对称内环形成的口袋结构)，影响翻译的多个步骤，特别是诱导密码子错读，干扰蛋白质合成，引起细菌死亡［8］。16SrRNA甲基化酶使细菌核糖体30S亚基16SrRNA的A位点中一个或几个碱基甲基化，使氨基糖苷类不能与相应靶位结合，导致细菌耐药［19］。armA使A位点G1405上的N-7甲基化，甲基化后阻碍G1405的N7与4，6-二取代脱氧链霉胺类3″氨基群之间的氢键形成，在空间上阻碍G1405与庆大霉素的环Ⅲ结合，甲基化也给G1405引入正电荷，不利于氨基糖苷类结合到解码位点。其他介导4，6二取代脱氧链霉胺类耐药的16SrRNA甲基化酶也是甲基化G1405位点相应的碱基。NpmA则甲基化16SrRNA的A1408上的N-1，同时介导对4，6二取代脱氧链霉胺和4，5二取代脱氧链霉胺类耐药［7］。该类酶直接作用于氨基糖苷类药物作用的靶位，引起对常用的几乎所有氨基糖苷类高水平耐药。这与氨基糖苷类修饰酶的耐药机制不同，修饰酶作用的底物具有特异性，不会引起泛氨基糖苷类耐药，且多为中等水平耐药。

4 16SrRNA甲基化酶的传播机制

目前已知的16SrRNA甲基化酶基因均位于质粒上，又常与Ⅰ类整合子或转座子相关联，这些结构与基因的移动、传播有密切关系。

4.1 armA 分离自腹泻猪的大肠埃希菌MUR050，其armA位于质粒pMUR050上，该质粒属于质粒IncN不相容群(分离自人的armA位于IncL/M质粒上)。armA位于复合型转座子上，介导其在人和动物分离的肠杆菌间传播。质粒转化后，受体菌也对4，6二取代脱氧链霉胺类耐药。该质粒上一组负责质粒复制、移动和结合的基因(如repA、oriT、tra家族)，与来源于鼠伤寒沙门菌的IncN群不相容性结合性质粒R46同源性99%，表明类R46复制子是armA的载体。研究发现，armA位于复合型转座子Tn1548上，上游为转座酶基因tnpU和由intⅠ1-ant 3″9-qacE△Ⅰ-sul1-orf513组成的Ⅰ类整合子，下游包括转座酶基因tnpD、大环内酯类外排泵基因mefE/ mel、大环内酯类磷酸转移酶基因mph，两侧为两拷贝的插入序列IS26［20］。armA复合型转座子也存在于其他细菌中。分离自波兰的弗氏枸橼酸杆菌pCTX-M3也存在类似的复合型转座子结构，其ant3″9上游还存在dhfrXⅡ基因。分离自法国肺炎克雷伯菌的armA位于结合性IncL/M型质粒pIP1204上，其上游为ISCR1和转座酶基因tnpU，下游为转座酶基因tnpD，并与介导广谱头孢菌素类耐药的blaCTXM相连［8］。大肠埃希菌也存在相同的遗传环境。最近报道分离自鸡大肠埃希菌pHNE的armA，其上游和上述报道相同，下游为 IS26、tnpA-Tn3-like和tnpA-Tn3-like结构，表明IS26和转座酶都参与armA的移动播散［21］。Kang等［22］报道armA位于多个结合性质粒上，如IncL/M、IncFIIAs、IncF、IncA/C、IncHI2，并且菌株对多种抗菌药物耐药。由多种不相容性群的结合性质粒介导armA在肠杆菌科细菌间传播可导致多重耐药菌的产生。

鲍曼不动杆菌armA的遗传环境与肠杆菌科中复合型转座子Tn1548的遗传环境基本相同，其上游orf513编码转座酶，形成ISCR1，并且常常与Ⅰ类整合子相连，转座酶基因tnpU也位于上游，下游为转座酶基因tnpD［17］。表明Tn1548是革兰阴性菌不同种系间armA有效的移动载体。

4.2 其他16SrRNA甲基化酶基因 铜绿假单胞菌AR-2的rmtA位于介导汞耐药的转座子Tn5041上，上游是转座酶基因类似序列(序列1)和tRNA核糖转移酶基因orfA，下游是类Na+/H－反向转运基因序列(序列2)。在AR-11中rmtA上游orfA被截断，由IS6100取代，下游仍为序列2，rmtA两端均有orfQ-orfI结构［23］;黏质沙雷菌S-95的rmtB位于非结合性但可电转化入受体菌的大质粒上，上游为一含blaTEM的转座子 Tn3，下游是编码转座酶的开放读码框orf2［10］。Doi等［24］又发现，rmtB 可能会被含有blaCTX-M的质粒捕获而传播;奇异变形杆菌ARS68的rmtC位于含转座酶tnpA的ISEcpI类似元件的下游［11］;铜绿假单胞菌PA0905的rmtD上游为整合子In163，两侧为ISCR14元件，下游为tRNA核酸转移酶基因和Tn5564部分结构。肺炎克雷伯菌R2中rmtD下游为Ⅰ类整合子，两侧为IS26［25］;目前，rmtE只在牛源性大肠埃希菌中发现，尚在研究中［13］;大肠埃希菌ARS3的npmA上游是3个开放读码框orf3、orf4及orf5，下游为orf7和orf8。含二拷贝IS26元件，形成转座单元［7］。

5 结语

目前，16SrRNA甲基化酶在不同国家、不同地区、不同菌种间分布具有明显差异。此类酶最初发现于肠杆菌科中［8］，大肠埃希菌携带的种类最多，包括armA、rmtB、rmtE、npmA，肺炎克雷伯菌也已检测到armA、rmtB，而在鲍曼不动杆菌中只检测到armA。该类耐药决定因子常与其他耐药基因共同存在于质粒、转座子等移动元件上，在不同菌种间广泛传播，导致多重耐药菌株的流行，特别是多重耐药鲍曼不动杆菌，使其对包括氨基糖苷类、碳青霉烯类等多种抗菌药物耐药。多重耐药的机制及相关耐药基因的播散成为微生物学、流行病学及临床医学关注的焦点。

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