血清microRNA的检测及临床应用进展

孙 伟(综述)，史冬泉，蒋 青(审校)

(南京医科大学附属鼓楼临床医学院关节中心，南京210008)

microRNA(miRNA)是近年来发现的一种能调节基因表达的小分子RNA，参与生物体的正常生长发育及肿瘤、系统性红斑狼疮、肝炎等疾病状态过程。检测血清miRNA表达谱对疾病的诊断、疗效判定及预后评估等方面有重要的临床意义。血清miRNA主要的检测方法有克隆测序、RNA印迹杂交、基因芯片、反转录-聚合酶链反应(reverse transcrip-tion polymerase chain reaction，RT-PCR)技术。目前，该项检测已在实验室及临床得到较广泛应用。

1 miRNA形成

miRNA是一组单链的、非编码的长度为21～25个单位的miRNA，在生物进化和疾病发展过程中起着调控作用。大量的mRNA被认为是miRNAs的靶向目标，并且一种 miRNA 可以靶向多种 mRNA［1，2］。miRNA在动物体内的形成过程大致如下:细胞核内编码miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成初级转录物 pri-miRNA［3］，pri-miRNA 在一种RNaseⅢ核酸酶作用下剪切miRNA前体pre-miRNA［4］。pre-miRNA在Dicer酶的作用下转化为成熟的miRNA。miRNA与靶信使RNA(mRNA)3'非翻译区(UTR)特异性地结合从而使其降解或者抑制其翻译［5］，进一步来调控基因表达。miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖和细胞凋亡、脂肪代谢、细胞分化、神经分化、病毒感染机制及肿瘤的发生发展等方面［6］。

2 血清miRNA的特点及检测

RNA分子易于降解，这在一定程度上限制了体液中RNA分子作为生物标志物的应用。但是前一阶段的大量研究表明，血清中存在着稳定miRNA［7-10］，血清miRNA在室温、高温、不同pH、多次冻融后仍能检测到，并且含量变化不大［7］，而此时大多数RNA都会降解。这就为血清miRNA作为生物标志物进行检测提供了可能。对于发现新的miRNA分子，克隆测序仍是首选方法［11，12］。RNA 印迹杂交，主要包括Northern杂交和原位杂交，是验证和确认miRNA的重要方法，但该方法繁琐并且灵敏度较低，不适用于临床样本的高通量检测［13］。芯片技术检测方法可以实现快速、高通量检测［14］。目前已有多种类型的miRNA检测芯片可以选用。但是，基因芯片检测方法的重现性和准确性比较差，过去一般多用于初筛，现在已经发展到第二代基因芯片技术，即Solexa测序，研究人员可通过其大量的平行测序，发掘、鉴定并定量出任何物种全基因组水平的miRNA图谱。应用这种低成本快速测定数百万标签序列的新方法，对获得的结果通常需要采用RT-PCR进行验证［7，15］。RT-PCR方法是基于PCR原理的检测方法，主要包括基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)、基于polyA 加尾的 RT-PCR 方法［16，17］和实时定量或非半定量RT-PCR。使用RT-PCR方法检测血清miRNA所获得纯度高，方法也较为简便，是现在测定血清miRNA的常用方法。

3 血清miRNA在疾病诊治中的应用

3．1 血清内miRNA与肿瘤 肿瘤领域是血清miRNA研究最早、涉及病种最多的研究领域，涉及的肿瘤包括全身各个系统。一种miRNA可以调控多个下游的数百个基因，因此，通过miRNA获得的信息比蛋白编码基因更能对癌症的亚型进行分类［18，19］。通过分析肿瘤患者与正常对照者血清miRNA表达的差异，有可能筛选到特异性好、灵敏度高、可作为特定肿瘤分子标志物的miRNA。在某些肿瘤患者血清中上调表达的miRNA，在另一些肿瘤中可能表达下调，提示血清miRNA在不同条件下可行使癌基因或抑癌基因的功能。Mitchell等［20］的研究证明，转移性前列腺癌患者血清中miR-141含量是健康男性对照组的46倍，可成为检测前列腺癌的血清miRNA标志物。Resnick等［10］通过研究患有卵巢癌妇女与正常妇女血清中的miRNA和CA125发现，miR-21、miR-92、miR-93在患者组的表达水平明显增高，患者组中有3例未经手术的患者CA125正常，但其 miR-21、miR-92、miR-93仍然显著增高。Hu等［15］最新研究发现，非小细胞肺癌长期生存患者与短期生存患者血清miRNA表达差异。用Solexa法选取在两组患者血清中都表达的且表达差异＞5倍的11种miRNA进行样本血清qRT-PCR验证，最后得到5种具有显著差异的 miRNA，其中 miR-486、miR-30d、miR-1、miR-499可作为非小细胞肺癌的生存预期的生物标志物。

3．2 血清内miRNA与肝病 肝脏中含有大量的miRNA-122，Bihrer等［21］从患有慢性丙型肝炎的患者和正常人中分别抽取血清进行miR-122检查，同时对患者组进行肝功能组织学检查，结果发现慢性丙型肝炎患者血清中miR-122水平明显高于正常对照组，并且miR-122水平与肝脏炎症程度指标具有相关性，miR-122与肝脏的谷丙转氨酶水平和肝脏坏死性的炎症强度相关，但与肝功能和肝纤维化程度无明显相关性。因此，血清miR-122可作为慢性丙型肝炎坏死性炎症的生物标志物。还有研究小组研究了乙型肝炎患者以及乙肝病毒阳性的肝癌患者血清中 miRNA，Li等［22］选取正常对照组 210 例，乙型肝炎患者135例，丙型肝炎患者48例，乙型肝炎病毒阳性的肝癌患者120例。取乙型肝炎患者与乙型肝炎病毒阳性肝癌患者血清miRNA分别与对照组使用Solexa测序及qRT-PCR验证，结果分别发现13个和3个有明显差异的 miRNA，这 13个血清 miRNA(miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423、miR-23b、miR-23a、miR-342-3p、miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150、let-7c)可以作为乙型肝炎的生物标志物，3种可以作为乙型肝炎病毒阳性肝癌标志物的 miRNA(miR-375、miR-25 和 let-7f)。

3．3 血清内miRNA与系统性红斑狼疮 之前已经有较多文献报道组织miRNA与免疫系统疾病相关。Wang等［23］研究了系统性红斑狼疮患者与正常对照组的血清miRNA发现，miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-205 和 miR-192 在患者血清中表达水平明显低于正常对照组，其中后5个与肾小球滤过率相关，miR-200a、miR-200c与蛋白尿呈负相关，系统性红斑狼疮病情程度与miR-200a呈负相关，血清miR-200b、miR-192与血小板计数相关，miR-205与红细胞计数和血细胞比容相关。

3．4 血清内miRNA与其他疾病 血清中miRNA作为生物标志的研究不仅局限于以上领域，也在其他疾病的诊治应用中取得了进展。Kong等［24］发现，在新诊断的2型糖尿病患者中，有7种血清miRNA水平明显增高，即 miR-9、miR-29a、miR-30d，miR-34a、miR-124a、miR-146a 和 miR-375。Gilad 等［8］选取10个妊娠早期的母体血清和10个妊娠末3个月的母体血清，以及10个年龄与前两组相匹配的非怀孕女性血清，检测血清中包括胎盘特异性miRNA［25］在内的28种 miRNA的表达水平，发现怀孕妇女与未怀孕妇女的血清miRNA水平明显不相同。所有胎盘miRNA在孕期血清中高表达，表达水平随妊娠周数增加而升高，其中有12个miRNA增加超过了5倍。并且发现miR-526a、miR-527在妊娠末期明显增加(超过 600倍)。胎盘中 miR-526a、miR-527和miR-520d-5P的表达水平可准确用于诊断是否妊娠。

4 展望

血清miRNA研究已经成为世界生命技术领域的研究热点，并且这种趋势还会延续下去。随着对miRNA作用机制的进一步研究，将会使人们对高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。而与此同时，通过利用各种最新的技术手段对血清miRNA和疾病间的关系进行研究也将使miRNA可能成为疾病诊治的新的生物学标志物，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。目前对于miRNA的了解还处于初始水平，只有很小部分miRNA生物学功能得到阐明，而对于绝大多数的miRNA的生物学机制和功能知之甚少，这些都是需要进一步研究和探索的。

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