丝素蛋白在组织工程中的应用和降解性研究

袁 凯

丝素蛋白在生物医学广为应用。经过几十年的研究应用，人们发现丝纤维在许多临床应用当中都有应用价值。然而与此同时，这种蛋白会引起一些生物反应，这就对其生物相容性提出了质疑。经过大量的研究，明确认识到蚕丝表面的丝胶蛋白是在蚕丝的生物相容性和超敏反应中引起不良反应的主要因素。如果将蚕丝外层的丝胶蛋白去掉，机体对剩余的丝素蛋白(丝心蛋白)的生物反应就与其他大部分常用的生物材料相似。另外，有学者认为蚕丝不能降解。但现在已经有明确的证据证明，蚕丝作为一种蛋白，在体内对蛋白水解酶的降解作用很敏感，并且经过更长的时间会被慢慢的吸收。

一、组织工程支架

组织工程需要各种不同性能的生物材料，从而满足体外组织实验的需求。生物材料在将环境信息传给基质内细胞方面发挥了重要的作用。在原有环境和新的组织之间，生物材料起到桥梁作用，帮助新的组织发挥其生物学作用。生物材料必须能够支持细胞黏附、扩散、生长和分化。大多数情况下，如果生物材料可以降解为宿主细胞能够代谢的生物碎片或单体会更好，但是，降解速度必须等于或者小于组织的生长速度。二者之间的平衡可以确保宿主机体和新的植入组织在物理和生理方面更好的完成整合。

1.丝素蛋白的生物相容性:在组织工程基质支架设计中，蚕丝丝素蛋白具有广泛的用途，包括骨、韧带、肌腱、血管和软骨组织工程，其良好生物学作用是成功的关键因素。Inouye等证实了丝素蛋白膜与胶原基质一样，都具有支持细胞的生长和生物学功能［1］。Minoura等用L－929成纤维细胞系来比较丝素蛋白膜、丝胶蛋白膜和胶原基质在支持细胞黏附、扩散和生长方面的能力。结果说明，丝素蛋白膜和胶原基质膜在支持细胞黏附、生长和细胞形态学方面的能力相同，而丝胶蛋白则没有相同的功能［2］。因此去除了丝胶蛋白的丝素蛋白适合作为培养细胞和组织的基质。Sufia等的研究发现，在体外将成骨细胞培养在丝素蛋白膜上，可以诱导骨组织生长［3］。如果在体外用RGD(Arg2Gly2Asp)肽段对丝素蛋白进行化学修饰来促进整合素介导的细胞黏附，那么诱导骨形成的能力将会显著增强。4周后，这种作用将会依赖升高的碱性磷酸酶水平、上调的骨特异性因子、以及钙离子的水平。

2.丝素蛋白在韧带组织工程中的应用:在组织工程中蛋白质的功能是提供多种位点来进行特异性的化学偶联，丝素蛋白就有这种优点。现在关于蚕丝蛋白的研究集中在自体组织工程领域，将其加工成线状基质，利用病人自己的成人干细胞，从而形成前交叉韧带(ACL)［4］。韧带强劲的性能，膝关节运动性，这些对生物材料的生物相容性和强大的机械性能都有很严格的要求。模拟体内环境，在体外将人骨髓干细胞培养在胶原基质中，可以诱导形成韧带成纤维细胞和成熟的组织。然而，胶原基质的整合性比较差，膝关节内的动力环境和生化要求比较高，另外蚕丝具有良好的机械性能和生物相容性，人们认为蚕丝是一种长远的有前途的可吸收材料。

Dunn等［5］做了一项研究，他用胶原制备了ACL修复体。结果显示，在兔子模型中有不连续的新生韧带形成，该修复体机械性能也很差。人们开始研究改进的支架材料如胶原纤维－PLA复合体，希望其具有新生韧带组织生长过程中所需要的机械性能。在这两项研究中，支架置入4周后只有一半的结构保持完整，这就说明了胶原纤维－PLA复合体无法满足ACL体内复杂环境的要求。蚕丝特有的机械性能，以及可以被制成线状的特点，使人们可以更好地控制最后制得的纤维的机械性质，从而模仿ACL在体内的机械特点，支持宿主组织向支架内生长，这就为ACL组织工程提供了新的途径。

3.丝素蛋白在骨组织工程中的应用:以骨组织来说，优良的生物材料必须能够抵抗压力，而我们知道蚕丝在压力下功能状态良好，很少出现断裂或破碎的情况，此时其他合成的高性能纤维往往就会失败［6］。采用电纺丝的方法制的丝素蛋白支架能支持骨髓基质细胞的黏附和增殖，而且Kim等的研究表明采用这种方法获得的纳米纤维膜能够引导骨再生［7，8］。将骨形成蛋白－2载入丝素蛋白膜后可诱导骨髓基质细胞向骨分化，该细胞能高表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨钙素和 cbfa1［9］。目前学者仍在探索，希望能够找到一种理想的基质材料，这种基质材料能满足所要求的几何形状和硬度，从而能有效的支持体外和体内组织的生长。

4.丝素蛋白在软骨组织工程中的应用:成人的软骨是一种无血管的组织，因而自修复能力较差。自体细胞移植软骨组织工程可用于治疗由创伤和骨关节炎引起的软骨组织损伤。该组织工程技术需要三维的多孔支架提供软骨细胞生长和分化以及新的软骨特异性基质的形成。丝素蛋白已被用于体外软骨组织工程［10～12］。采用盐溶解的方法可制备多孔的三维丝素蛋白支架［13］，将骨髓基质细胞置入三维丝素蛋白支架3周后形成了关节周围的2型胶原［14］。Uebersax等的研究表明，载有胰岛素生长因子的丝素蛋白支架能支持骨髓基质细胞的生长，缓释的胰岛素生长因子诱导骨髓基质细胞向成软骨方向分化［15］。

二、丝素蛋白的降解

按照美国药典的说法，可吸收材料是指在置入体内60天内大部分拉伸强度会丧失的材料。按照这个定义，蚕丝是属于非降解性的。然而，许多文献表明，蚕丝是降解性的，只是要很长时间，其降解性是FBS(胎牛血清)介导的蛋白水解作用引起的。体外研究证明，糜蛋白酶可以将蛋白质结晶较少的区域水解为多肽，多肽再被细胞吞噬掉从而进一步的被消化［16］。在蛋白酶 －14的作用下，丝素蛋白24天可降解65%，而在PBS(磷酸盐)缓冲液中则无降解［17］。在皮下种植的老鼠模型中，蚕丝在植入后第10天丧失了29%的拉伸强度，在第30天丧失了73%，在第70天丧失了83%［18］。Lam等认为蚕丝具有生物降解性，该研究将干纺热拉的聚乳酸纤维与几种可吸收非降解性缝线置入老鼠皮下的肌肉层中。扫描电镜观察PLLA(聚L乳酸粒子)，PDS(聚对苯二氧杂环己酮纤维)，Vicryl和黑色编织蚕丝在体内2周后便有降解的迹象。除了单股尼龙纤维，其他所有的缝线在第2周时都会诱发慢性的炎症反应。第24周，在体内即没有蚕丝，也没有炎症反应，这很可能是由于蛋白水解酶将蚕丝快速的消化了。到第6周，置入Vicryl的机体内的炎症反应已经消失，第80周，机体置入的PLLA周围仍有慢性的炎症反应［19］。一般来说，蚕丝在机体内吸收的比较慢。置入位点、物理环境、可变因素、蚕丝类型(有没有去除丝胶蛋白)以及蚕丝纤维的直径均决定了吸收速度，其中可变因素包括病人的生理状况和健康状况［20］。另外，蚕丝加工处理方法不同也会导致蛋白结构发生变化，这就可能会使其更容易降解或者更难降解［21］。这些变量都没有详细的研究，因此很难确定蚕丝蛋白结构、加工方法和降解性之间的关系。但蚕丝蛋白在体内可以降解，以上所涉及的变量不同，降解率也不同。

鉴于丝素材料良好的生物相容性，用丝素蛋白做人造血管、人造皮肤等器官一直受到广大学者的青睐。关于丝素膜烧伤覆盖材料的研究，通过测定丝素膜的含水率、断裂强度、柔韧性、透水性、创面黏合力等各种物理和生物学指标，发现其具有一定的透水性，并能与创面产生良好的初期黏合。丝素膜用做人工皮肤的愿望也指日可待。在今后的研究中，多孔丝素膜将能引导新生血管长入，诱导真皮组织的再生，在真皮再生过程中多孔丝素膜逐步被降解，成为真皮再生的支架和真皮的永久性替代物。

目前被期待的丝素生物医学材料大都属于软组织用材料，要求材料有一定的柔韧性。但是目前除了丝素膜之外，丝素材料的柔韧性和强度等还远远达不到生物医学材料实用性的要求。因此，许多学者利用各种化学改性的方法，如交联等，来提高材料的强度和柔韧性。

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