NR3亚单位的研究进展

朱敏侠 朱大年

NMDA受体属于配体门控阳离子通道。传统NMDA受体主要由NR1亚单位和不同的NR2亚单位组成。NR1是形成NMDA受体的基本亚单位，NR2为调节亚单位。NR1亚单位上有甘氨酸结合位点，NR2亚单位上有谷氨酸结合位点。NMDA受体激活的条件是:神经细胞膜去极化使结合于通道内的Mg2+移出，同时甘氨酸和谷氨酸分别与NR1、NR2上相应的位点结合。受体激活后，除Na+和K+通透性增加外，主要引起Ca2+通透性增加，Ca2+大量内流。内流的Ca2+对于突触可塑性、脑的学习和记忆功能，以及脑卒中和癫痫等神经退行性变都具有重要意义［1～4］。最早关于NR3亚单位的报道见于1995年，研究发现它不影响非NMDA受体(KA和AMPA受体)所产生的电流，而是可能特异地与NMDA受体亚单位相互作用形成新型受体，并产生不同于传统NMDA受体的新特性。

一、NR3亚单位的结构

1.1995年，由两个研究小组分别报道了NR3A，最初被命名为χ－1(chi－1)或NMDAR－L(NMDAR－like)［5，6］。人的 NR3A 开放阅读框由 9 个外显子编码，编码基因GRIN3A位于染色体9p34，有1115个氨基酸残基，相对分子质量为125kDa。NR3A与NR1具有27%的同源性，与NR2具有24% ～29%的同源性，与非NMDA受体亚单位具有23%的同源性。尽管同源性低，但NR3A仍被归为NMDA受体，这是因为它的羧基末端及M1上游与其他NMDA受体亚单位结构相关［5］。NR3A具有谷氨酸受体家族共有的特性，包括1个4次跨膜结构域形成的孔道、胞外氨基末端配体结构域以及编码信号肽的疏水区和糖基化作用位点、1个胞内羧基末端。与其他NMDA受体亚单位一样，胞内羧基末端有蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)、蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)和钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的磷酸化位点。这提示在NR3A的转运、信号转导和通道特性的调节上，磷酸化可能起到重要的作用［7］。已在大鼠证实，NR3A mRNA至少存在两种变体，即羧基末端胞内结构域第3007位核苷酸处有1个60bp插入片段的长剪接变体(NR3－long;NR3－l)，和没有插入片段的短剪接变体(NR3－short;NR3－s)。人的NR3A基因序列中没有此插入片段。NR3－l的插入片段可形成20个氨基酸残基，上有 PKA、PKC和CaMKⅡ的磷酸化位点［8］。人和大鼠NR3A亚单位在氨基酸水平上同源性较高，约为93%，大多数糖基化和磷酸化位点高度保守;但大鼠NR3A羧基末端缺少富含脯氨酸的序列，因此不能和突触后致密区脚手架蛋白的PDZ(PSD－95/discs large/zona occludens－1)结构域结合，含NR3A亚单位的受体在突触的聚集和稳定还要依赖NR2亚单位和PDZ结构域的结合，这也解释了含有NR3A亚单位的NMDA受体表达不稳定的原因;而人NR3A胞内羧基末端有人类特异的羟脯氨酸序列，可以结合脚手架蛋白的SH3(Src homology 3 domain)结构域［9］。

2.2001～2002年，有关NR3B亚单位的功能特性有了较为全面的报道［10～12］，最初被命名为 χ －2。人NR3B的可读框由9个外显子编码，编码基因GRIN3B位于染色体19p13.3，有1043个氨基酸残基。小鼠NR3B的开放阅读框有1003个氨基酸残基，分子质量为109.2kDa;大鼠NR3B的可读框有1002个氨基酸残基，分子质量为109kDa。NR3B和NR3A约有47%的同源性，与NR1、NR2的同源性为17%～21%，与非 NMDA受体家族的同源性为13% ～16%［11］。人NR3B基因全长有9165 bp，小鼠为6205 bp，这种差异主要是由于人基因中有较长的内含子造成的。人NR3B的氨基酸序列有74.9%与小鼠相同，而其他6个NMDA受体亚单位的氨基酸序列约有89.0% ～99.8%与小鼠相同。特别是人NR3B的外显子9翻译出的氨基酸序列比小鼠长很多，相同序列只有37.8%。人NR3B外显子9编码两个CaMKⅡ位点和两个PKC位点，这在小鼠是没有的。大多数其他的糖基化和磷酸化位点在种属之间具有保守性［13］。NR3B具有谷氨酸受体氨基末端典型的跨膜拓扑结构，4个膜联结构域和N－糖基化位点。小鼠NR3B胞内羧基末端有3个苏氨酸残基和5个丝氨酸残基，这可能是磷酸化位点。羧基末端以丙氨酸－谷氨酸－丝氨酸结尾，缺少其他谷氨酸受体和PDZ结合的结构域［10］。通过BLAST检索发现，没有与NMDA受体亚单位的同源基因序列，所以NR3B很可能是NMDA受体家族的最后1个成员。NR3B具有NMDA受体家族高度保守结构，包括S1和S2的激动剂结合域和跨膜结构。NR3B和NR3A相似，在M2区有离子通道孔，这与NR1和NR2明显不同。NR3A和NR3B的这些特点可能赋予NMDA异聚体未知的配体结合和门控特性［11］。

二、NR3亚单位的表达分布

1.通过对大鼠出生后NR3A蛋白表达的动态观察发现，发现在生后第2天，大脑皮质、海马和中脑的NR3A蛋白水平已很高，在第7～10天达到高峰，随后下降，第30天降至稳定水平，第42天仍能检测到。在生后第2天，小脑NR3A表达水平最高，随后下降，在第10天降至成年水平。于生后第5天，嗅球NR3A蛋白水平达到高峰，然后下降至成年水平。在生后第7天，小脑和嗅球的NR3A蛋白水平约为皮质、中脑和海马的25%，这个比率在小脑、嗅球和中脑、海马之间一直维持到成年。于生后第42天，小脑NR3A蛋白水平最低。NR3A的表达具有时间和空间特点，总体来看，在胚胎发育后期，NR3A转录水平增加，并在出生后前2周达到高峰，主要在脊髓、脑干、下丘脑、背侧丘脑、海马CA1区和杏仁核，随后迅速下降。在成年大鼠，其高表达主要是在背侧丘脑和杏仁核。这个亚单位的瞬时表达说明它在早期神经元分化、迁移和突触形成的过程中起重要作用［5，14］。

2.通过对C57BL/6J小鼠NR3B mRNA表达的研究，发现NR3B主要在运动神经元表达。从孕15天的胚胎至生后7天的小鼠，NR3B mRNA在脑和脊髓，包括三叉神经运动核、面神经核、舌下神经核尚未有表达，而在出生后第14天，这些脑干运动核开始表达，直至成年［10，15］。起初认为 NR3B 的表达非常局限，主要在脊髓、脑干、小脑和海马［11］。但随着研究的深入，发现NR3B在大鼠前脑(海马、大脑皮质、基底核节区和付核)、小脑和脊髓腰段都有广泛表达。在这些区域，如海马CA1、CA3和齿状回、大脑皮质的各层、投射神经元、纹状体的中间神经元、小脑的各型细胞上，以及脊髓的运动神经元都有表达，且与NR1共表达［16］。

三、NR3亚单位赋予NMDA受体新特性

在瓜蟾卵母细胞上，NR3A或NR3B可同NR1形成受甘氨酸调节的兴奋性受体NR1/NR3A或NR1/NR3B。NR3亚单位上有甘氨酸结合位点，所以含有NR3亚单位的受体对甘氨酸敏感且亲和力高，但不受谷氨酸和NMDA的影响，对Mg2+、MK－801和美金刚以及竞争性拮抗剂均不敏感，对Ca2+相对通透。此型受体激活后产生的内向电流比传统NMDA受体小。传统NMDA受体NR1亚单位上甘氨酸位点的激动剂，如D－丝氨酸、D－丙胺酸、D－环丝氨酸和1－氨基环戊烷羧酸，对NR1/NR3B受体甘氨酸诱导的电流产生有抑制作用。当没有甘氨酸作用时，D－丝氨酸可单独激活NR1/NR3B受体，但与甘氨酸的激活效应相比，作用较弱。对于NR1/NR3A受体来说，D－丝氨酸是1个强拮抗剂，单独作用也不能产生激动效应。也有文献报道，在瓜蟾卵母细胞上未检测到功能性的NR1/NR3A受体，这可能是由于甘氨酸激活NR1/NR3A受体产生的电流快速失敏所造成的［11］。

上述甘氨酸在含有NR1/NR3A或NR1/NR3B的瓜蟾卵母细胞上诱导产生内向电流的现象，尚未在转染了这两型受体的哺乳动物细胞上被观察到。在HEK293细胞，NR1/NR3A或NR1/NR3B受体不能在甘氨酸或谷氨酸诱导下产生电流，但是NR1/NR3A/NR3B可在甘氨酸诱导下产生较强的门控电流。尽管和NR1亚单位一样，NR3亚单位也结合甘氨酸，但当NR1缺乏或被NR2取代时，将不能产生内向电流，说明NR1对于NR1/NR3A/NR3B是非常重要的。该受体不被谷氨酸或红藻氨酸激活，也不受甘氨酸受体或甘氨酸转运体拮抗剂的影响，许多传统的NMDA受体拮抗剂，如 2－amino－5 phosphonovalerate(APV)、艾芬地尔、美金刚、MK－801等都不能阻断该受体。APV和艾芬地尔不能发挥作用是因为它们要和NR2亚单位的位点结合。通道阻断剂美金刚、MK－801不能发挥作用是因为NR1/NR3A/NR3B受体上的通道结构域不同于传统的NMDA受体。传统的NMDA受体甘氨酸位点激动剂D－丝氨酸可以部分激活NR1/NR3A/NR3B受体，拮抗剂5，7－dichlorokynurenic acid(5，7DCK)可以阻断受体电流［17］。

P8小鼠顶枕皮质神经元上的NMDA受体在NMDA诱导下，其单通道电流减小，对Mg2+不敏感，可被APV阻断，这些特性不能归于传统NMDA受体或NR1/NR3受体，所以推测，这可能是NR1/NR2/NR3受体所特有的。采用NR3A转基因小鼠海马神经元培养技术，发现NR1/NR2/NR3A受体对Mg2+不敏感，Ca2+内流减少［18］。瓜蟾卵母细胞上也可形成NR1/NR2A/NR3A和NR1/NR2A/NR3B受体，这些受体在NMDA/甘氨酸作用下所产生的电流与传统NMDA 受体相比较小［11］。

四、NR3亚单位的作用及与疾病的关系

1.研究表明，与野生型小鼠相比，敲除内源性NR3A后小鼠的NMDA电流幅度增大，树突棘密度增加［19］，突触成熟加快，而NR3A的持续表达会通过限制突触生长和减少棘突密度来阻止谷氨酸能突触的成熟，并伴有学习和记忆过程的损害。但重要的是，随后突触和认知缺陷可以恢复，提示只要NR3A表达恢复正常，突触也会适时成熟。NR3A独特的瞬时表达特点使它就像一个管家，保证出生后脑发育过程中突触在适当的时候成熟［20］。大鼠脊髓也有丰富的NR3A表达，表明在一些感觉处理过程中含有NR3A的NMDA受体的重要性［9］。

在NR3A基因敲除小鼠和野生型小鼠的大脑皮质神经元的培养过程中，用不同浓度的NMDA加上5μmol/L甘氨酸诱导细胞发生兴奋性毒性损伤。与野生型小鼠比较，当NMDA浓度在100或200μmol/L时，NR3A基因敲除小鼠的神经元凋亡细胞数目明显增多，梗死面积明显增大，成年后中枢神经系统极少高表达NR3A，但视网膜位列其中。成年NR3A基因敲除小鼠及野生型小鼠视网膜中注入NMDA，7天后观察视神经节细胞，发现当NMDA浓度为2nmol时，NR3A基因敲除小鼠存活的视神经节细胞数目小于野生型小鼠的75%。用NR3A转基因小鼠制作大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型发现，与野生型小鼠相比，NR3A转基因小鼠的脑梗死面积明显减小，且神经行为学评分比野生型小鼠高。这些研究结果均表明NR3A具有神经保护作用［21］。

有报道观察到精神分裂症者的前额叶皮质背外侧(dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC)NR3A mRNA表达增加，但仅限脑回区域，而在双向情感障碍者，NR3A mRNA于整个前额叶皮质背外侧区表达都减少［22］。但也有文献报道，精神分裂症者 DLPFC区NR3A的表达和正常对照组比较没有差异，但与男性比较，女性DLPFC区NR3A表达显著降低，提示雌激素可以下调NR3A的水平［23］。

2.在对NR3B的研究中发现，NR3B过表达会增加树突的长度、错综程度和树突足的数量，提示NR3B可以促进发育中的运动神经元长出更多的分支［24］。

通过NR3B亚单位是否会影响重组NMDA受体麻醉敏感性的研究发现，尽管NR3B的掺入会显著减小NR1/NR2受体通道的电流幅度，但是NR1/NR2/NR3B受体对氯胺酮、异氟醚、氧化亚氮和乙醇的敏感性没有改变。NR3A的作用可能和NR3B相同［25］。

NMDA受体除了在神经细胞表达外，还在其他细胞上表达，如NR3B mRNA在外周血淋巴细胞上表达。通过对阿片类药物成瘾研究发现，与对照组比较，戒断组、阿片成瘾组和美沙酮维持组的 NR3B mRNA表达明显上调;然而，与戒断组和成瘾组比较，美沙酮维持组NR3B mRNA表达明显下调。慢性阿片滥用可导致成瘾个体NR3B mRNA表达明显上调，含有NR3B的NMDA受体可以通过减少通道对钙离子通透性而抑制受体的活动。因此，成瘾个体外周血淋巴细胞NR3B的上调可造成这些细胞NMDA受体转运活动的抑制。美沙酮维持治疗可以减少外周血淋巴细胞NR3B亚单位的过表达，因此NR3B可以用作评估治疗成功与否的标志［26］。

NR3B基因敲除小鼠的社会行为可发生改变，表现为在它们自己鼠笼内与熟悉同伴的社交活动增多，但在新环境中出现焦虑样行为中度增多伴随社交活动减少。这些社会行为的改变与NR3B在NMDA受体功能上的负性调节有关［27］。

五、结 语

在哺乳动物的不同成长发育阶段，NR3亚单位的表达特点使之可能参与新型NMDA受体的构成，并表现出不同于传统NMDA受体的新特性，对于机体的正常生理发育和在某些疾病状态下都具有重要意义。近来年尤其受到关注的是，在一些由NMDA受体介导的兴奋性毒性损伤的疾病中，通过调节含有NR3受体的表达来减少Ca2+内流引起的神经元损伤，可为疾病的治疗找到新靶点，这也是今后研究的方向。

1 Nowak L，Bregestovski P，Ascher P，et al.Magnesium gates glutamate－activated channels in mouse central neurones［J］.Nature，1984，307(5950):462 －465

2 Johnson J W，Ascher P.Glycine potentiates the NMDA response in cultured mouse brain neurons［J］.Nature，1987，325(6104):529 －531

3 Mcbain C J，Mayer M L.N －methyl－D －aspartic acid receptor structure and function［J］.Physiol Rev，1994，74(3):723 －760

4 Mori H，Mishina M.Structure and function of the NMDA receptor channel［J］.Neuropharmacology，1995，34(10):1219－1237

5 Ciabarra A M，Sullivan J M，Gahn L G，et al.Cloning and characterization of chi－1:a developmentally regulated member of a novel class of the ionotropic glutamate receptor family［J］.J Neurosci，1995，15(10):6498－6508

6 Sucher N J，Akbarian S，Chi C L，et al.Developmental and regional expression pattern of a novel NMDA receptor－like subunit(NMDAR－ L)in the rodent brain［J］.J Neurosci，1995，15(10):6509－6520

7 Chen B S，Roche K W.Regulation of NMDA receptors by phosphorylation［J］.Neuropharmacology，2007，53(3):362 －368

8 Sun L，Margolis F L，Shipley M T，et al.Identification of a long variant of mRNA encoding the NR3 subunit of the NMDA receptor:its regional distribution and developmental expression in the rat brain［J］.FEBS Lett，1998，441(3):392－396

9 Eriksson M，Nilsson A，Samuelsson H，et al.On the role of NR3A in human NMDA receptors［J］.Physiol Behav，2007，92(1－2):54 －59

10 Nishi M，Hinds H，Lu H P，et al.Motoneuron－specific expression of NR3B，a novel NMDA－type glutamate receptor subunit that works in a dominant－ negative manner［J］.J Neurosci，2001，21(23):C185

11 Chatterton J E，Awobuluyi M，Premkumar L S，et al.Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits［J］.Nature，2002，415(6873):793 －798

12 Matsuda K，Kamiya Y，Matsuda S，et al.Cloning and characterization of a novel NMDA receptor subunit NR3B:a dominant subunit that reduces calcium permeability［J］.Brain Res Mol Brain Res，2002，100(1－2):43－52

13 Bendel O，Meijer B，Hurd Y，et al.Cloning and expression of the human NMDA receptor subunit NR3B in the adult human hippocampus［J］.Neurosci Lett，2005，377(1):31－36

14 Al－ Hallaq R A，Jarabek B R，Fu Z，et al.Association of NR3A with the N－methyl－D－aspartate receptor NR1 and NR2 subunits［J］.Mol Pharmacol，2002，62(5):1119 －1127

15 Fukaya M，Hayashi Y，Watanabe M.NR2 to NR3B subunit switchover of NMDA receptors in early postnatal motoneurons［J］.Eur J Neurosci，2005，21(5):1432－1436

16 Wee K S，Zhang Y，Khanna S，et al.Immunolocalization of NMDA receptor subunit NR3B in selected structures in the rat forebrain，cerebellum，and lumbar spinal cord［J］.J Comp Neurol，2008，509(1):118－135

17 Smothers C T，Woodward J J.Pharmacological characterization of glycine－activated currents in HEK 293 cells expressing N－methyl－D－ aspartate NR1 and NR3 subunits［J］.J Pharmacol Exp Ther，2007，322(2):739－748

18 Tong G，Takahashi H，Tu S，et al.Modulation of NMDA receptor properties and synaptic transmission by the NR3A subunit in mouse hippocampal and cerebrocortical neurons［J］.J Neurophysiol，2008，99(1):122－132

19 Das S，Sasaki Y F，Rothe T，et al.Increased NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A［J］.Nature，1998，393(6683):377 －381

20 Roberts A C，Diez－Garcia J，Rodriguiz R M，et al.Downregulation of NR3A－containing NMDARs is required for synapse maturation and memory consolidation［J］.Neuron，2009，63(3):342 －356

21 Nakanishi N，Tu S，Shin Y，et al.Neuroprotection by the NR3A subunit of the NMDA receptor［J］.J Neurosci，2009，29(16):5260 －5265

22 Mueller H T，Meador－Woodruff J H.NR3A NMDA receptor subunit mRNA expression in schizophrenia，depression and bipolar disorder［J］.Schizophr Res，2004，71(2 －3):361 －370

23 Henson M A，Roberts A C，Salimi K，et al.Developmental regulation of the NMDA receptor subunits，NR3A and NR1，in human prefrontal cortex［J］.Cereb Cortex，2008，18(11):2560 －2573

24 Prithviraj R，Inglis F M.Expression of the N－methyl－D－aspartate receptor subunit NR3B regulates dendrite morphogenesis in spinal motor neurons［J］.Neuroscience，2008，155(1):145－153

25 Yamakura T，Askalany A R，Petrenko A B，et al.The NR3B subunit does not alter the anesthetic sensitivities of recombinant N－methyl－D－aspartate receptors［J］.Anesth Analg，2005，100(6):1687 －1692

26 Sedaghati M，Vousooghi N，Goodarzi A，et al.Expression of NR3B but not NR2D subunit of NMDA receptor in human blood lymphocytes can serve as a suitable peripheral marker for opioid addiction studies［J］.Eur J Pharmacol，2010，633(1 －3):50 －54

27 Niemann S，Kanki H，Fukui Y，et al.Genetic ablation of NMDA receptor subunit NR3B in mouse reveals motoneuronal and nonmotoneuronal phenotypes［J］.Eur J Neurosci，2007，26(6):1407－1420