EML4-ALK在非小细胞肺癌中的表达及检测

梁 宁(综述)，单 利，王 强(审校)

(新疆医科大学附属肿瘤医院内一科，乌鲁木齐830011)

原发性支气管肺癌(简称肺癌)为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一。在肺癌中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占绝大多数。随着近年新的治疗方法和技术不断涌现，使得NSCLC的诊断和治疗较20世纪70年代有了长足的发展。肿瘤分子靶向治疗是指针对参与肿瘤发生、发展过程的细胞信号转导和其他生物学途径的一种治疗手段。它可以对肿瘤生长的关键通路采用小分子化合物阻断其关键酶(酪氨酸激酶)，或采用各种单克隆抗体与其特异的生长因子或其受体进行竞争性结合，从而达到阻断肿瘤细胞生长的作用。NSCLC靶向治疗主要包括单克隆抗体、抑制酶/蛋白活性的小分子药物、抗血管生成药物、抑制蛋白翻译的反义RNA以及与细胞内分子特异性作用的药物等。

1 棘皮动物微管结合蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因的概述

在肺癌的分子靶向治疗领域，研究热点一直集中在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、K-ras和血管内皮生长因子等靶点上，涌现出许多针对这些靶点的分子靶向药物。随着对EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)研究的进一步深入及多中心的Ⅲ期临床研究结果的陆续披露，靶向治疗与患者临床特征之间的关系越来越明确。同时也发现，不是所有优势人群(亚裔、女性、不吸烟、腺癌)都能够通过EGFR-TKI获益，EGFR突变状态是决定EGFR-TKI疗效的关键因素，使用EGFR-TKI后有些可以获得疾病的长期缓解，有些会在TKI初始有效后出现获得性耐药，还有一些患者则原发性耐药。目前已有研究证实［1］，EGFR 20号外显子的突变与EGFR-TKI获得性耐药有关，而K-ras基因突变则与EGFR-TKI的原发耐药有关［2］。棘皮动物微管结合蛋白4-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4，EML4-ALK)融合基因与EGFR突变的不共存现象以及含有该基因患者的鲜明临床特征，提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标志物。ALK激酶的分子靶向药物克里唑蒂尼(crizotinib)在晚期EML4-ALK融合基因阳性NSCLC患者的Ⅰ期临床试验中效果令人满意，直接获准进入Ⅲ期临床研究［3］，备受关注。

2007年，Soda等［4］在1例62岁的吸烟肺腺癌患者手术切除的标本中，扩增出一个由3926 bp组成的DNA片段，可以编码一个由1059个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白的氨基端(残基1～496)是人类EML4编码蛋白(基因库编NM-019063)的一部分，而羧基端(残基497～1059)则由ALK(基因库编号AB209477)编码蛋白的一部分构成。因此，研究者认为，编码这一蛋白的基因很可能是EML4和ALK的融合基因。进一步研究发现，该融合基因由第2号染色体短臂插入引起，至今已经发现6个变异亚型，分别为亚型1(E13;A20)、亚型2(E20;A20)、亚型3(E6a/b;A20)、亚型4(E14;A20)、亚型5(E2;A20)、亚型 6(E18;A20)［5，6］。经检测，所有这些融合基因均有生物学功能，表达产物为一种嵌合型酪氨酸激酶。

2 EML4-ALK与NSCLC的关系

前期的几项研究表明，EML4-ALK的融合仅发生于肺腺癌患者。Soda等［7］首先发现了该融合基因，运用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测了261例恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胃肠道肿瘤)均未检测出该基因。Inamura等［8］使用RT-PCR的方法检测221例肺癌患者，其中腺癌149例，鳞癌48例，大细胞癌3例，小细胞癌21例，结果只在腺癌患者中检测到5例有融合基因的mRNA表达，表达率为 3.4%(5/149)。Fukuyoshi等［9］检测了肺癌(104例)、胃肠道肿瘤(555例)、乳腺癌(90例)等标本，发现104例肺癌标本中仅有1例EML4-ALK转录，而其余结果均为阴性，于是多数研究者认为，EML4-ALK属NSCLC所独有。但2009年，Lin等［5］在其他肿瘤中也发现了 EML4-ALK，包括乳腺癌(5/209)，结直肠癌(2/83)，及 NSCLC(12/106)，但仍以NSCLC为最高。

3 EML4-ALK与EGFR-TKI的关系

多项研究发现，EGFR-TKI有效的患者一般都有其独特的临床病理特征，如亚裔、女性、不吸烟、腺癌。进一步的研究证实，EGFR的19、21外显子突变是决定EGFR-TKI疗效的关键［10］。由此可见，拥有上述临床病理特征的患者，EGFR突变的可能性大。那么，EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者是否有其独特的临床病理特征?Takahashi等［11］对2001年5月至2005年7月在京都大学医学部胸外科诊断为NSCLC并接受手术治疗的313例患者进行EML4-ALK融合基因发生率及相关因素分析的研究，该研究采用RT-PCR方法检测肿瘤组织的EML4-ALK融合基因，并用直接测序法验证，结果显示，111例女性患者中4例有EML4-ALK融合基因，202例男性患者中仅有1例。所有EML4-ALK融合基因患者均为腺癌、少吸烟或不吸烟者且不与EGFR、K-RAS突变共存。Shaw等［12］研究了141例满足两个以上筛选条件(女性、亚裔、不吸烟或少吸烟、腺癌)的NSCLC患者。采用荧光原位杂交技术检测EML4-ALK融合基因的发生率并用免疫组化方法检测ALK表达水平，结果表明，13%的患者具有EML4-ALK融合基因，22%的患者EGFR突变，65%的患者两者均为野生型。与EGFR基因突变和两种基因均野生型的患者相比，EML4-ALK融合基因在年轻男性患者中更多。EML4-ALK融合基因患者与两基因均野生型患者相比，不吸烟或少吸烟者更少。94.7%的 EML4-ALK融合基因存在于腺癌患者中，且此类融合基因患者接受EGFR-TKI治疗后效果不明显。Wong等［13］对266例NSCLC患者的手术冰冻标本进行EML4-ALK融合基因检测，结果发现13例表现为EML4-ALK融合基因阳性，共包含4种变异亚型，其中8例为亚型3(E6;A20)，2例为亚型1(E13;A20)，2例为亚型2(E20;A20)，1例为亚型 5(E18;A20)。这 13例EML4-ALK融合基因阳性患者中，11例为腺癌，2例为腺鳞癌。此外，该研究发现不吸烟者的EML4-ALK融合基因阳性率更高;EGFR突变阴性与EML4-ALK融合基因阳性呈正相关;EML4-ALK融合基因阳性者较阴性者的年龄更小。随着对EML4-ALK研究的不断深入，EML4-ALK融合基因代表了NSCLC中具有独特病理和临床特征的新一类亚型。其主要存在于非吸烟或少吸烟的腺癌患者中，而且通常与EGFR基因不同时存在。

4 EML4-ALK基因的检测方法

越来越多的标本进行了EML4-ALK融合基因的检测，不同的检测方法层出不穷，荧光原位杂交技术、RT-PCR、免疫组化、cDNA末端快速扩增技术均可检测EML4-ALK融合基因，哪种检测方法更快捷，敏感性、特异性更高成为了大家面临的新问题。多数学者采用RT-PCR法进行EML4-ALK融合基因的检测，也有研究者采用荧光原位杂交技术法检测。Mino-Kenudson等［14］针对 ALK融合基因的新型抗体(美国细胞信号转导技术公司的兔单克隆抗人CD246抗体，克隆号:D5F3或D9E4)，采用免疫组化法筛查来自临床的石蜡标本，并通过PCR和荧光原位杂交技术等检测方法进行验证，结果显示，与传统检测淋巴瘤ALK表达的小鼠来源标准抗体相比，敏感性、特异性均有明显提高。Zhang等［15］运用cDNA末端快速扩增技术对广东省人民医院、广东省肺癌研究所2003～2006年通过手术切除及穿刺活检等手段获得的103例NSCLC冷冻组织标本进行 EML4-ALK 融合基因检测。Sakairi等［16］对109例经支气管镜超声内镜引导下纵隔淋巴结穿刺标本进行EML4-ALK融合基因检测，得出了与原发灶组织标本检测类似的结果。荧光原位杂交技术可以从病理切片或细胞涂片上检测少数细胞的融合变异，是目前CrizotinibⅢ期临床试验的入组检测方法，但有限的探针片段有时会降低其敏感性。免疫组化可检测肿瘤特异性抗原的表达，但传统免疫组化试剂敏感性较低，即使使用新型免疫组化试剂，结果也可能是微弱和局部的，此外，对结果的判断也具有主观性。RT-PCR的优势在于其检测的高敏感性，但此法的缺点是:不能检测EML4-ALK融合基因的未知亚型;对引物的要求高;检测甲醛固定的石蜡包埋切片，RNA易大量降解而降低其敏感性。

5 针对EML4-ALK基因的抑制剂

任何一个肿瘤新靶点的发现，最后都着眼于设计出安全有效的药物，在分子水平上治疗肿瘤。由辉瑞公司研制的Crizotinib治疗ALK融合基因阳性NSCLC患者的Ⅰ期临床试验初步结果显示［17］，在50例可评价疗效患者中，客观缓解率达64%，8周疾病控制率达90%，6个月无进展生存率达72%，虽然中位无进展生存期尚未达到，但中位治疗时间已超过25.5周。主要不良反应是胃肠道反应，但患者均可耐受。鉴于此，美国食品药品管理局批准Crizotinib直接进入Ⅲ期临床试验。

6 结语

EML4-ALK融合变异目前已经被鉴定为NSCLC，特别是肺腺癌的一个独特的分子亚型，EML4-ALK融合基因阳性患者有其独特的临床病理特征，如何根据这些临床病理特征，筛选ALK融合阳性的患者成为主要关注的问题。目前有多种技术可检测EML4-ALK的融合，这些技术各有优缺点，存在一定的互补性。研究初步显示，Crizotinib治疗ALK融合基因阳性NSCLC患者有效且不良反应可耐受。针对这一靶点的深入研究，将有助于筛选EGFR-TKI合适的治疗人群并开启NSCLC靶向治疗的新领域。

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