DNA甲基化与宫颈癌的研究进展

巫剑红（综述），代荫梅（审校）

（首都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，北京 100026）

宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，居女性恶性肿瘤第2位，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一［1］。人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染被认为是宫颈癌病因学最重要的危险因素，几乎存在于所有的宫颈癌中。虽然HPV的感染只是宫颈癌发生的必需但病因不充分，即在宫颈癌的自然形成过程中尚需要其他辅助因素的参与，但其诱导宫颈癌变发生的分子生物学机制尚不明确。近年的研究发现，表观遗传学的改变可能在宫颈癌变发生、发展中发挥着重要作用，这提示通过检测基因的甲基化水平来进行宫颈癌的早期诊断具有重要的临床意义，DNA甲基化可能作为有效的分子标志物应用于宫颈癌筛查［2］。现就DNA甲基化与宫颈癌关系的研究进展予以综述。

1 DNA甲基化与CpG岛

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容，其实质是在DNA甲基化转移酶（DNA methytrasferase）的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基共价结合到胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的过程。几乎所有的甲基化胞嘧啶残基都出现在对称序列的5'-GC-3'核苷酸（5'-GC-3'nucleotide，CpG）上。在哺乳动物基因组中，CpG二核苷酸以两种形式存在:一种分散于DNA中，约70%以甲基化形式存在，可称其为甲基化CpG位点;另一种是非甲基化的CpG二核苷酸高度聚集在基因的5'端，其范围为0．5～2．0 kb，富含CG（60%～70%），称 CpG岛（CpG island）。人类基因组中约有45 000个CpG岛，以非随机化的方式分布于蛋白编码基因的启动子和第一外显子区域，虽然仅占基因组DNA的1%～2%，但存在于所有管家基因和少量组织特异基因的5'端调控区。CpG岛在正常组织中处于非甲基化状态，而在肿瘤组织中却被甲基化，这种甲基化状态的改变抑制基因转录，使基因表达沉默，从而诱发细胞癌变，是引起肿瘤发生的一个重要因素。

2 DNA异常甲基化与宫颈癌

目前很多研究已经在多种肿瘤中证实肿瘤相关基因的异常甲基化现象，如p16甲基化是表观遗传学上肿瘤抑制基因失活的典型。近20年来，国内外对宫颈癌DNA甲基化的研究也越来越多，研究中采用了各种各样的方法分析宫颈脱落细胞、宫颈活检组织和血浆样本，证明了宫颈癌中DNA甲基化现象的普遍存在。

2009年，Wentzensen等［3］对 Medline中的文献进行综合分析，发现共有51项研究对4376例宫颈癌样本的68种不同基因的甲基化状态进行了研究，其中在5项或超过5项的研究中分析了15种基因，7种基因的甲基化频率在宫颈癌中＞60%，其中死亡相关蛋白激酶 1（death-associated protein kinase，DAPK1）、细胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）和β视黄酸受体（retinoic acid receptorβ，RAR-β）在整个研究中始终显示出甲基化增高。这些数据说明，在宫颈癌肿瘤组织中基因甲基化现象广泛存在。不仅如此，研究还发现，部分基因甲基化的频率随着宫颈病变级别的增加而增加，甲基化基因的数目也随着宫颈上皮内瘤变程度的加重而增多［4-7］。这提示DNA甲基化发生于宫颈癌变过程的早期阶段，表观基因不稳定性逐渐增加可能与宫颈病变逐渐加重有关。但目前研究涉及的有关基因数目众多，研究结果各异。Feng等［8］采用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR，MSP）技术研究了319例脱落细胞样本中21个甲基化基因，最后确定了3个基因（DAPK1、RAR-β和碱性螺旋蛋白基因）对检测宫颈浸润癌和宫颈上皮内瘤变Ⅲ的灵敏度和特异度较高，均为95%。Kim等［9］采用巢式MSP技术检测12个基因的甲基化，结果发现RAR-β、碱性螺旋蛋白基因和O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因最能区别鳞状细胞癌/鳞状上皮内高度瘤变（squamous cell carcinomas/high-grade SIL，SCC/HSIL）和鳞状上皮内低度病变/正常宫颈组织（low-grade SIL/normal cervix，LSIL/NC），灵敏度和特异度分别为 78．7% 和 82．2%。Apostolidou 等［10］在HSIL/NC的液基细胞样本中，采用荧光定量MSP方法研究了28个基因，发现3个基因（同源盒基因、同源框A11基因和CADM1）的甲基化水平明显升高，并且证明同源框A11基因可作为液基细胞样本的DNA甲基化标志物。这些结果表明，即使同一个基因，在各项研究中的DNA甲基化水平也相差很大。

上述研究都是随机选择已经发现的在肿瘤中普遍甲基化的基因，逐个评估它们在宫颈癌及癌前病变中的甲基化状态。近年来，随着甲基化检测的深入开展，涌现出限制性标记基因组扫描、甲基化敏感性随机引物MSP、甲基化CpG岛扩增和甲基化基因芯片等高通量检测甲基化的新技术。应用这些新技术可以直接针对宫颈癌筛选出甲基化变异程度最高的基因。Lai等［11］采用 CpG岛芯片技术在 NC、LSIL、HSIL和SCC样本中分析基因甲基化状态，筛选出了6个新的甲基化基因:同源盒基因、配对核基因X1、LIM同源框转录因子1基因、NK6转录因子相关基因座1、Wilm's肿瘤基因和ONECUT1（one cut homeobox 1），并评估了这6个基因的甲基化水平，结果发现配对核基因X1的甲基化变异程度最高，对于SCC的灵敏度和特异度分别为86%和82%，对于HSIL/SCC的灵敏度和特异度分别为54%和99%。Wang等［12］采用限制性标记基因组扫描技术检测20例SCC和NC的甲基化状态，最早筛选出核仁蛋白基因和脂肪瘤高迁移率组融合配偶体4基因在宫颈癌中存在明显甲基化。Sova等［13］利用表达芯片筛选浸润性宫颈癌的差异表达基因，然后分析差异表达基因的甲基化状态，发现了分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白基因、组织因子旁路抑制物2基因、Ras相关糖尿病基因、分泌型卷曲相关蛋白1基因、富含半胱氨酸金属硫蛋白1G基因和15号染色体开放阅读框架48基因的甲基化与浸润性宫颈癌相关。高通量检测技术大大促进了宫颈癌早期诊断甲基化标志物的筛查工作。但是，目前尚未真正筛选到满足临床需要的高特异度敏感诊断标记的甲基化基因，仍需要进一步发现更好、更多的甲基化标志物，以提高敏感性和特异性。

3 DNA甲基化在宫颈癌诊断中的临床应用前景

宫颈癌是全世界妇女死亡的主要疾病之一。近年来细胞学筛查大大降低了宫颈癌的发生率和病死率，但是在可疑微小病灶中，它的敏感性低，重复率差，尤其对于宫颈上皮内低度病变组织。HPV-DNA和宫颈细胞学联合检测使初步筛查宫颈上皮内瘤变Ⅱ及以上的敏感性大大提高。然而，高危HPV检测在诊断宫颈上皮内瘤变时虽然具有敏感性，但是缺乏特异性，HPV-DNA检测结果阳性几乎都只提示暂时性的感染而非浸润性宫颈癌的结局，许多HPV阳性的患者并不发展为宫颈癌，而是处于双向发展趋势。因此，需要寻求合适的方法对HPV-DNA阳性患者进行分类，以判断宫颈病变的发展趋势，从而确定下一步的工作是继续随访还是临床干预。

为此，有人提议引进DNA甲基化标志物来提高传统细胞学筛查的效果。利用DNA甲基化标志物筛查宫颈癌的优点是:①DNA甲基化标志物性质稳定，从而使检测可行。②可在前一次作细胞学检查的残留样本中检测，避免患者再次门诊，更加方便经济，减少资源浪费。③利用荧光定量MSP方法只需少量肿瘤细胞或肿瘤细胞的DNA片段即可检测到DNA甲基化，而用液基细胞学方法检测时，因样本中含有很多正常宫颈细胞，可能检测不到相对较少的异常细胞，从这个角度来说，荧光定量MSP检测可能优于细胞形态学检测［14］。然而，DNA甲基化标志物也存在缺陷。作为筛查宫颈癌的一种方法，最重要的先决条件是:①测量的可靠性，而各种甲基化基因在各项研究中甲基化水平差异很大。②检测疾病时较高的敏感性和特异性，从而有较高的阳性预测值。而在Wentzensen等［3］综合分析的68种基因中，甲基化水平最高的3个基因（DAPK1、CADM1和RAR-β）在宫颈癌中的平均甲基化率只有30%，因此单个DNA甲基化基因筛查宫颈癌的特异性并不高。

对此，有些研究者采用甲基化基因标记系列筛选宫颈癌。Wisman等［15］在宫颈癌病例组和正常对照组的宫颈涂片中采用荧光定量MSP技术检测了12个基因的甲基化，结果发现降钙素基因相关肽基因、雌激素受体基因、组织金属蛋白酶抑制因子3、腺瘤性结肠息肉病基因、DAPK和RAR-β的甲基化水平在宫颈癌中明显高于对照组。降钙素基因相关肽基因、雌激素受体基因、腺瘤性结肠息肉病基因和DAPK标记系列检测的灵敏度达89%，与细胞形态学和高危HPV检测的灵敏度（89%和90%）一致，而特异度优于细胞形态学和高危HPV检测（100%、83% 和68%）。Kahn等［16］采用荧光定量MSP技术分析了HSIL、LSIL和正常宫颈组织的液基细胞中免疫球蛋白超家族基因、分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白基因、组织因子旁路抑制物2基因和DAPK的甲基化频率和水平。结果发现每个基因的甲基化频率在HSIL样本中都高于LSIL，这4个基因的甲基化标记系列可用于区分 HSIL和 LSIL/NC。Wentzensen等［3］认为 DAPK1、CADM1 和 RAR-β 联合检测可能是最理想的，还有研究显示甲基化标记系列结合黏附分子3、人端粒酶反转录酶基因、红细胞膜41L3基因和13号染色体开放阅读框架18基因较好［17］。然而，假如这些甲基化标志物互相排斥，完全独立，或者只是从一定程度上关联，都会影响标志物系列的覆盖范围，从而对标志物联合检测的敏感性产生重要影响。因此，如果没有经过正式的评估和标准方法的验证，这些都是不确定的。Lai等［11］实验中同时对宫颈拭子进行HPV和配对核基因X1检测比单独进行HPV检测提高了HSIL/SCC检测的灵敏度（从60%到80%），而特异度变化不大（63%和64%），这说明，采用HPV和DNA甲基化联合检测，高敏感性和高阳性预测值的检测相结合的方法是最理想的。从临床意义上来说，对HPV检查结果阳性的患者，进一步进行DNA甲基化检测，可以筛查出一部分HPV阳性却没有严重宫颈病变的患者，减少阴道镜活检的伤害［18，19］。

Widschwendter等［20］首次在宫颈癌患者的血清样本中检测降钙素基因相关肽基因、人端粒酶反转录酶基因、肌原决定基因、孕酮受体基因和组织金属蛋白酶抑制因子3的甲基化状态，结果发现血浆DNA中肌原决定基因没有甲基化的患者比甲基化的患者存活率高，提示血浆中检测出的肌原决定基因甲基化可用于宫颈癌淋巴结转移和复发的预后标志物。Yang等［21］在研究中发现CADM1的甲基化与宫颈癌的浸润程度和宫颈淋巴血管间隙浸润有关，提示CADM1在宫颈癌的转移和浸润中有重要作用。这说明，DNA甲基化标志物不仅可用于宫颈癌的早期诊断，还可用于判断宫颈癌的肿瘤转移程度、临床预后及是否复发。

4 展望

目前，国内外对宫颈癌甲基化的研究已有大量报道，发现了一大批基因的甲基化与宫颈癌发生有关，但尚未真正筛选出在灵敏度和特异度方面都能满足临床需要的甲基化标志物。既往的研究多是针对一种或多种在其他肿瘤中常见的甲基化基因在宫颈癌组织中进行表达评估，而针对宫颈癌特异的甲基化基因进行全基因组的系统筛选的研究甚少。因此，需要开展新的平台来检测大量的CpG岛DNA甲基化位点，从而发现更好更多的宫颈癌DNA甲基化标志物，并通过独立样本实验验证这些新的标志物，以最终确定高特异度的敏感诊断标记。从经济效益和可行性考虑，未来宫颈癌的人群筛查方法可能是建立在HPV联合DNA甲基化的检测系统上，这种联合可达到100%的灵敏度，且特异性高于只用HPV或细胞学的方法。另外，甲基化早期诊断在临床上往往适合于非创伤性的样本。总之，采用全基因组筛选宫颈癌甲基化基因的方法，找到最适合的甲基化标志物，进而在宫颈涂片样本中检测宫颈癌甲基化标志物是未来的研究方向。宫颈癌DNA甲基化标志物将为临床宫颈癌的早期诊断和治疗提供新的思路和方法。

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