斑马鱼loc558117基因的多克隆抗体制备

李 志,姚立群,雷孝锋,王 琨,莫小阳,吴秀山

（湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙 410081）

斑马鱼loc558117基因的多克隆抗体制备

李 志,姚立群,雷孝锋,王 琨,莫小阳,吴秀山＊

（湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙 410081）

loc558117基因是trim45在斑马鱼中的同源基因,小鼠及果蝇研究结果表明该基因与血细胞发育有关.利用PCR技术扩增斑马鱼loc558117基因部分编码区,并将其插入到原核表达载体pET-28a中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒（pET-28a-loc558117）转入Rosseta感受态细胞,通过IPTG诱导表达融合蛋白,his柱子亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体.获得了loc558117原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗loc558117多克隆抗体.为进一步研究loc558117功能提供了有力工具.

斑马鱼;loc558117;融合蛋白;多克隆抗体

脊椎动物血液发育是一个错综复杂的过程[1-2].起源于热带的斑马鱼其心血管、血液、肝肾等系统与人类相应系统有许多相似之处,且斑马鱼易饲养,产卵数量多,具有体外受精、胚胎发育快、透明等优点而被公认为是脊椎动物类研究的最佳模式动物,广泛应用于发育生物学、分子生物学、遗传学、胚胎学等领域.因此研究斑马鱼为研究脊椎动物血液发育作用机制,进而为血液疾病的治疗提供绝佳的平台.

Trim45是trim家族中的一种,其在心血管发育方面有重要作用[3].在斑马鱼中,trim33与s mad家族蛋白作用,通过TGFβ信号通路来影响造血作用[4-6].作为进化保守的tr im45的同源基因,loc558117与trim33有着几乎相同的结构域,且有实验证明其影响血液标志基因的作用[7-8],因此很有可能在整个血液发育中具有重要的作用.

本实验制备斑马鱼loc558117的抗体,为研究该基因在斑马鱼血液发育作用中的分子机制以及表达情况,并为进一步利用斑马鱼模型研究血液发育的蛋白调控工作奠定基础.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

大肠杆菌菌种为实验室已有保种:E.coliDH5α和E.coliRosseta;斑马鱼cDNA文库、载体pET-28a由本实验室提供;内切酶B amHⅠ和XhoⅠ、Taq DNA聚合酶及Loading buffer购自Fermentas公司;pMD18-T载体、连接酶和buffer购自大连Takara公司;DNA胶回收试剂盒（离心柱型）购自Tiangen;质粒提取试剂盒（100管型号）购自进口公司OMEGA;Ni- IDA凝胶柱蛋白纯化试剂盒、蛋白胨、酵母提取物、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）等均购自上海sangon生物.

1.2 引物设计与合成

利用http://www.proteinlounge.com/peptide_finder/default.asp网站在线分析选出loc558117蛋白氨基酸序列亲水性最佳的一段并根据巢式pcr原理设计2对引物;第一对:LOC558117Isense:5′GTCTCACTCCATCCAG ACCCTACA3′LOC558117 Ianti:5′TGACCTTCACAACCTCGCTCC 3′.第二对带有酶切位点;LOC558117 IIsense: 5′GCGGGATCC CTGGAGGAGTCTTT 3′,LOC558117 IIanti:5′ACGCTCGAGCACAACCTCGCTCC3′由深圳华大基因公司合成.其中带下划线碱基分别为B am hⅠ和XhoⅠ的酶切序列,前面3个碱基为保护序列.

1.3 loc558117的基因克隆与扩增

首先提取斑马鱼总RNA再反转录得到总cDNA,以此为模板用第一对引物PCR扩增,再用第二对引物进行loc558117特异扩增.反应条件是:95℃变性4 min;95℃30 s,55℃30 s,72℃50 s,反应30个循环;72℃终延伸8 min.得到PCR产物为491 bp,经纯化连T载体,转化DH5ɑ大肠杆菌,挑取单克隆培养,提质粒后经B amHⅠ和XhoⅠ双酶切检测得到阳性克隆.用B amHⅠ和XhoⅠ双酶切pMD-18-T-loc558117,目的片段纯化后连入经同样两种酶切纯化后的pET-28a载体,转化DH5α大肠杆菌,再经双酶切检测得到正确重组载体,将该重组载体质粒送至华大基因公司进行测序分析.

1.4 loc558117融合蛋白诱导表达

将正确的重组子pET-28a-loc558117转化Rosseta感受态细胞,挑取单个菌落,接种于15 mL含50 mg/L卡纳青霉素的培养基中,37℃培养12 h过夜,次日按1∶50的比例转瓶接种至20 mL的含50 mg/L卡纳青霉素的培养基中,转2瓶,至OD600约为0.5～0.6时,按0.2 mol/L加入IPTG诱导,分别在25℃和37℃恒温箱中培养,经诱导4、8、12、24 h分别取1 mL诱导培养菌,重悬于pH8.0的PBS溶液中,超声破碎离心取上清,以未加IPTG诱导的菌液为对照,SDS-PAGE电泳鉴定.

1.5 loc558117融合蛋白亲和纯化

将大量诱导处理的细菌培养物超声裂解、液氮反复冻融,高速离心取上清.低温下再将上清与经binding buffer漂洗后的Ni- IDA凝胶柱充分结合,Washing buffer洗去杂蛋白,Elution buffer来洗脱目的蛋白以获得纯化的his-loc558117融合蛋白,-80℃保存.

1.6 loc558117多克隆抗体制备

于20 kg健康雄性新西兰大白兔耳缘静脉取血1 mL,制备免疫前正常血清为阴性对照.将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,凝胶在0.25 mol/L KCl中4℃浸泡15 min.用洁净的刀片切下显现的目的蛋白并磨碎,加入PBS与弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合液,注射器中推成乳剂,进行背部皮下多点注射,注射应慢而均匀,注射点尽量分布在背部各处大约10点左右.在第14、21、28 d同样方法目的蛋白用PBS与弗氏不完全佐剂体积比1∶1混合在兔子背部皮下多点注射免疫.第35 d主动脉取血后置于在4℃冰箱过夜,离心取血清分装保存于-80℃.

1.7 loc558117多克隆抗体效价检测

将pET-28a-loc558117转化Rosseta诱导表达总蛋白处理后跑SDS-PAGE胶,用兔血清PBST稀释后进行Western Blot检测.选出最佳效价比例进行loc558117基因以后的研究.

2 实验结果

2.1 loc558117基因的PCR扩增和克隆

以斑马鱼总cDNA为模板,用loc558117两对引物进行PCR扩增得到的特异产物,经纯化后片段如图1所示,大小正确.

将目的基因克隆到pMD-18-T载体中,BamHⅠ和XhoⅠ双酶切处理重组质粒,目的片段连入同样处理的pET-28a载体.BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定并送测序,实验结果显示pET-28a-loc558117已经构建成功（图2）.

图1 loc558117的PCR纯化产物

图2 pET-28a-loc558117重组载体及其双酶切鉴定结果

2.2 loc558117融合蛋白的诱导表达

把pET-28a-loc558117转化Rosseta的菌株在温度为25℃和37℃,IPTG浓度为0.2 mmol/L的条件下诱导,分别在不同时期取样,跑SDS-PAGE胶的结果如图3所示,融合蛋白分子量约24 000.

图3 重组子pET-28a-loc558117在Rosseta中的表达

2.3 loc558117融合蛋白的纯化

把pET-28a-loc558117转化Rosseta的菌株在37℃,IPTG浓度为0.2 mmol/L下,诱导过夜,超声处理后离心,取上清与经binding buffer漂洗后的Ni- IDA凝胶柱充分结合,Washing buffer洗去杂蛋白,Elution buffer来洗脱目的蛋白以获得纯化的his-loc558117融合蛋白,进行SDS-PAGE电泳,经过考马斯亮蓝染色显示为图4结果,有杂带.免疫前用SDS-PAGE分析后,切胶处理.

2.4 loc558117多克隆抗体W estern-blot鉴定和斑马鱼组织蛋白检测

用pET-28a-loc558117转化Rosseta菌株诱导表达的总蛋白进行Western-blot鉴定,自制loc558117多克隆抗体做效价检测,分别1∶50,1∶500,1∶1 000,1∶2 000稀释后作一抗进行检测,用未处理兔血清做对照,目的带大小位置有一条特异性带出现（见图5）.说明本次制备的loc558117多克隆抗体具有很好的特异性,达到了用于进一步实验的需要.

图4 融合蛋白his-loc558117的纯化

图5 多克隆抗体的Western-blotting鉴定

3 讨论

本工作目的是获得loc558117原核表达融合蛋白,制备高效价和特异性好的兔抗的多克隆抗体,用于进行loc558117基因的功能研究.采用的pET-28a载体优势在于其N,C两端都含有编码Histag蛋白标签的序列,这样就能保证即使有一端有移码突变,目的蛋白仍带有标签蛋白,这样诱导表达后无论在上清或沉淀中都能用Ni- IDA凝胶亲和纯化柱获得目的蛋白.

用于表达蛋白的Rosseta菌能有效准确地翻译目的蛋白.蛋白诱导过程中,蛋白易以包涵体的形式表达,而包涵体形成后蛋白须经变性、复兴等复杂处理过程后才能得到可溶性融合蛋白质.因此应摸索最适宜的诱导温度、时间和IPTG的浓度等条件,使融合蛋白在上清中表达.作者发现,在诱导温度为37℃,IPTG浓度为0.2 mmol/L的条件下诱导20 h,融合蛋白在上清中能大量表达.

本研究中,作者将获得的目的蛋白his-loc558117免疫新西兰大白兔,第一次注射用完全弗氏佐剂,用量稍少,间隔时间可长些,约2周.以后用不完全弗氏佐剂,注射量可增大,间隔时间也可缩短至1周.

loc558117具有环形锌指、B盒型锌指、螺旋卷曲螺旋结构域,这3种结构域共同形成一个三元模体和一个IG-FLMN结构域,是一种典型的锌指蛋白基因[9].而锌指转录因子如GATA2,SAMD4,S MAD5,SCL等在小鼠、斑马鱼等脊椎动物血液发育尤其血细胞分化中有着重要的作用[10-11],这为以后的研究指示了方向.

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Preparation of PolyclonalAntibody of Zebrafish Loc558117 Gene

L I Zhi,YAO L i-qun,LEI X iao-feng,WANG Kun,MO X iao-yang,WU X iu-shan＊
（The Center for HeartDevelopment,KeyLab.ofMOE forDevelopmentBiology and Protein Chemistry, Hunan NormalUniversity,Changsha 410081,China）

Theloc558117 gene is the homologous genes of thetr im45 in zebrafish,previous studies showed that it had some relationswith hematopoiesis in mouse and drosophila.In thiswork,loc558117 gene was amplified by PCR and then cloned into pET-28a vector.After identification by restriction enzyme and sequencing,the recombinant expression plasmid containingloc558117 gene was transfor med into Rosseta cells.The loc558117 fusion protein was induced by IPTG and purified protein using his- IDA sephrose,the loc558117 fusion protein was used to immuned the New Zealand white rabbits to prepare antibody.The antibody titer and specification were identified by Western blot.His fusion protein of loc558117 was obtained,and high sensitivity and specificity anti-loc558117 polyclonal antibodywas gotten.The resultswill be helpful for functional studies ofloc558117 gene in the future.

zebrafish;loc558117;fusion protein;polyclonal antibody

Q785

A

1000-2537（2011）02-0075-04

2010-12-24

国家自然科学基金资助项目（31071999,30771170,30971105,30971663,30871340,30671053,30970425, 30900851）;湖南省自然科学基金资助项目（10JJ1006）

＊通讯作者,E-mail:xiushanwu2003@yahoo.com.cn

（编辑 王 健）