王 菁, 张 园, 袁 媛, 陈光英*
(1.海南师范大学 生命科学学院,海南 海口 571158;
2.海南师范大学热带药用植物化学省部共建重点实验室,海南 海口 571158)
5种海南岛药用植物抗肿瘤活性部位的筛选
王 菁1,2, 张 园1,2, 袁 媛2, 陈光英2*
(1.海南师范大学 生命科学学院,海南 海口 571158;
2.海南师范大学热带药用植物化学省部共建重点实验室,海南 海口 571158)
筛选猪屎豆、蒌叶、喜光花、广南天料木和红花天料木等5种药用植物的抗肿瘤有效部位.采用MTT法测试了该5种药用植物不同溶剂萃取物对四种癌细胞的体外抑制活性.证明了该5种药用植物的部分提取物对4种肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用,量-效关系明显.
药用植物;活性部位;抗肿瘤作用;MTT法
癌症仍然是困扰全人类的最大难题之一,随着癌症发病率的升高,越来越多的学者们致力于癌症药物的寻找,而药用植物作为纯天然药物,成为学者们研究的热点[1].Cheong等发现金荞麦提取物能抑制肝癌细胞生长[2],Joseph在藤黄毛竹中分离出一种化合物具有抗HIV活性[3],Monika等人发现长叶暗罗的乙醇浸提物可以抑制人HL-60细胞的增长[4].本文研究的5种海南植物长期被海南黎族地区用作药物治疗各种疾病.该5种植物均为海南特有物种,其中蒌叶(Piper betleL1)、红花天料木(Homalium hainanensis)和广南天料木(Homalium paniculiflorum)的抗肿瘤活性为本文首次报道.试验以猪屎豆(Crotalaria mucronata Desv)的4种不同的溶剂(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇)萃取物,猪屎豆的叶、果、茎的乙醚提取物,蒌叶的3种不同的溶剂(石油醚、氯仿、水)提取物,喜光花(Actephi⁃la merrilliana)的4种不同的溶剂(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇)提取物,红花天料木和广南天料木的3种不同的溶剂(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)提取物,对四种肿瘤细胞的体外增殖抑制作用进行筛选,确定有效部位,测定有效部位的半数抑制率(IC50),为进一步研究该几种植物的抗肿瘤作用提供基础实验数据.
1.1 仪器
高压灭菌锅(日本森展企业有限公司);倒置显微镜(重庆光学仪器厂);ELx800酶标仪(BioTek公司);CO2恒温培养箱(日本SANYO公司);超净工作台(苏州净化设备厂);可调式移液器(BRAND公司);96孔细胞培养板(Pore公司);TB-215D电子天平(Sartious公司).
1.2 试药
RPMI1640培养液(Gibco公司),胰酶(Gibco公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma公司),超级新生牛血清(杭州四季青生物科技有限公司),二甲基亚砜(DMSO)(天津市化学试剂二厂).
1.3 材料
猪屎豆、蒌叶、喜光花、广南天料木和红花天料木均采自海南,由海南师范大学生命科学学院钟琼芯副教授进行鉴定,其标本保藏于海南省热带药用植物化学重点实验室.
1.4 细胞株
人肺腺癌细胞(SPCA-1)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人白血病细胞(K562),由南方医科大学提供.细胞培养于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.2%NaHCO3的RPMI1640培养液中,于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养.
1.5 供试样品的制备
取猪屎豆粗粉25 kg,75%乙醇水浴回流12 h,合并滤液,旋转蒸发仪回收溶剂,浸膏加水溶解,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,将萃取物回收溶剂并制成冻干粉,即得粗提物.分别取猪屎豆的叶、果、茎粗粉500 g,用300 mL乙醚30℃索氏回流8 h,所得乙醚提取物为挥发油组分,储存于4℃备用.取蒌叶粗粉500 g,75%乙醇水浴回流提取3次,每次3 h,合并滤液,旋转蒸发仪回收溶剂,浸膏加水溶解,依次用石油醚、氯仿萃取,将萃取物及萃取后剩余水层回收溶剂并制成冻干粉,分别得到氯仿、石油醚、水的提取物.取广南天料木粗粉17 kg和红花天料木粗粉200 g,加75%乙醇水浴回流3提取3 h,合并滤液,旋转蒸发仪回收溶剂,浸膏加水溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,将萃取物及萃取后剩余水层回收溶剂并制成冻干粉,即得粗提物.以上干膏均以50%DMSO为溶剂,精确配制成10 mg/mL供试样储备液,使用时用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释,使药液在96孔板中的浓度分别为100、10、1 μg/mL.
1.6 MTT比色法
人肺腺癌细胞(SPCA-1)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(GSC-7901)和人白血病细胞(K562)分别以2×104个/ml、7×104个/ml、4×104个/mL和1×104个/mL接种于96孔板中.每孔体积180μL,在CO2培养箱内培养8~12 h.待细胞贴壁后,加入不同浓度药液20 μL.加药细胞培养44h后,每孔加入MTT[5]溶液(1 mg/ml)50 μL,继续在培养箱内孵育4 h,取出倾去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min后,使用酶联免疫检测仪于570 nm测定各孔光吸收值.同时设置空白组(仅加入不含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物),算细胞增殖抑制率[6].以抑制率大于50%为有效.
1.7 IC50的测定
根据MTT实验初步筛选所得到的数据,选择有细胞增殖抑制活性的样品(浓度为100 μg/mL时抑制率>50%)进一步测定其半数抑制率IC50.以同一样品的浓度对数值作横坐标,以抑制率作纵坐标,作回归曲线,计算IC50.
1.8 数据处理
每份样本平行测定5孔,全部数据用SPSS13.0统计软件包进行统计分析.吸收值以均数±标准差(X±s)表示,采用方差分析比较组间均数差异.
2.1 5种海南药用植物的不同部位对人胃癌细胞(SGC-7901)的增殖抑制作用
猪屎豆的氯仿部位、喜光花的氯仿部位、喜光花的石油醚部位、广南天料木石油醚部位对人胃癌细胞(SGC-7901)的增殖有较好的抑制作用,均成剂量依赖性,在高剂量组细胞增殖抑制率可以达到80%以上,IC50均小于20 μg/mL;蒌叶的石油醚部位、红花天料木石油醚部位、红花天料木的乙酸乙酯部位对人胃癌细胞(SGC-7901)显示较弱的抑制作用.活性部位对胃癌细胞的抑制作用均成剂量依赖性,其余部位对人胃癌细胞(SGC-7901)的增殖抑制作用不明显,见表1.
2.2 5种海南药用植物的不同部位对人肺腺癌细胞(SPCA-1)的增殖抑制作用
喜光花的石油醚部位、广南天料木的石油醚部位对人肺腺癌细胞(SPCA-1)的增殖有较好的抑制作用,在高剂量组细胞增殖抑制率可以达到80%以上,IC50均小于20 μg/mL.其中喜光花石油醚的IC50达到5.34 μg/mL.猪屎豆叶的乙醚部位、红花天料木的石油醚部位对人肺腺癌细胞(SPCA-1)显示较弱的抑制作用.活性部位对胃癌细胞的抑制作用均成剂量依赖性,其余部位对人肺腺癌细胞(SP⁃CA-1)的增殖抑制作用不明显,见表2.
表15 种海南药用植物的不同部位对SGC-7901细胞增殖的影响(X±s,n=5)Tab.1 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on SGC-7901 cells(X±s,n=5)
表25 种海南药用植物的不同部位对SPCA-1的增殖抑制作用(X±S,n=5)Tab.2 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on SPCA-1 cells(X±s,n=5)
2.3 5种海南药用植物的不同部位对人白血病细胞(K562)的增殖抑制作用
猪屎豆的石油醚部位、猪屎豆叶的乙醚部位对人白血病细胞(K562)的增殖有较好的抑制作用,在高剂量组细胞增殖抑制率可以达到80%以上,IC50均小于20 μg/mL,其中猪屎豆石油醚部位的IC50达到3.49 μg/mL,猪屎豆叶的乙醚部位的IC50达到8.01 μg/mL.猪屎豆的氯仿部位和果的乙醚部位、喜光花的石油醚和氯仿部位、红花天料木的石油醚和乙酸乙酯部位对人白血病细胞(K562)显示较弱的抑制作用.活性部位对胃癌细胞的抑制作用均成剂量依赖性,其余部位对人白血病细胞(K562)的增殖抑制作用不明显,见表3.
2.4 5种海南药用植物的不同部位对人肝癌细胞(BEL-7402)的增殖抑制作用
喜光花和广南天料木的石油醚部位对人肝癌细胞(BEL-7402)的增殖有较好的抑制作用,在高剂量组细胞增殖抑制率可以达到80%以上.红花天料木的石油醚部位对人肝癌细胞(BEL-7402)显示较弱的抑制作用.活性部位对胃癌细胞的抑制作用均成剂量依赖性,其余部位对人肝癌细胞(BEL-7402)的增殖抑制作用不明显,见表4.
表35 种海南药用植物的不同部位对K562细胞增殖的影响(X±s,n=5)Tab.3 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on K562 cells(X±s,n=5)
表45 种海南药用植物的不同部位对BEL-7402的增殖抑制作用(X±S,n=5)Tab.4 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on BEL-7402 cells(X±s,n=5)
猪屎豆为豆科蝶形花亚科猪屎豆属半灌木状草本植物,药用可补肝肾,明目,固精[7].蒌叶为胡椒科胡椒属植物,具有祛风散寒、行气化痰、消肿止痒之功效[8].喜光花为大戟科喜光花属植物,用于通便、利尿、治疗水肿,结核、牛皮癣、疥疮和无名肿毒,肠炎痢疾,尤其是除疣、抗肿瘤等[9].红花天料木和广南天料木是天料木科常绿大乔木,是原产于海南的热带珍贵用材树种,被列为海南特类材,也是我国最珍贵的工业用材[10].用MTT法体外研究各活性部位对不同来源的肿瘤细胞株的作用,得到部分部位体外对肿瘤细胞增殖具有明显抑制作用,说明这些部位为该5种海南药用植物的有效作用部位.
该5种海南药用植物长期被海南黎族地区用作治疗药物,虽有文献报道从蒌叶中提取出木质素[11]和生物碱[12],但国内外对该5种药用植物的活性研究未见报道.为了开发出活性好、毒性低、来源广泛的抗肿瘤药物,药用植物可能含有抗癌活性极佳的化合物,例如三萜类[13-15]、生物碱类[16-18]等.通过选用不同来源、不同生长特性的细胞株进行实验,我们发现猪屎豆氯仿部位、喜光花的石油醚、氯仿部位和广南天料木的石油醚部位对胃癌细胞株,喜光花和广南天料木的石油醚部位对肺癌细胞株,猪屎豆的石油醚和叶乙醚部位对白血病细胞株,喜光花的石油醚部位对肝癌细胞株,在体外均有非常好的抑制作用,其IC50<30 μg/mL,并且对肿瘤细胞毒性呈剂量依赖关系,最高抑制效应均达到80%以上,符合被认为有研究的价值的要求[19].文献表明,肿瘤药物敏感实验的体外实验结果与体内化疗疗效总符合率高达85%[20].针对活性部位,探寻其中的物质基础,进一步进行活性成分分析,确定其有效物质成分,并进行一些相关的抗癌机理研究,将是我们今后研究的重点.
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Antitumor Activities of Different Extracts from 5 Kinds of Medical Plants in Hainan
WANG Jing1,2,ZHANG Yuan1,2,YUAN Yuan2,CHEN Guangying2*
(1.College of Life Science,Hainan Normal University,Haikou 571158,China;
2.Key Lab of Tropical Pharmaceutical Herb Chemistry of Hainan province,Haikou 571158,China)
The anti-tumor active extracts of 5 kinds of medicinal plants were screened,which are Crotalaria mucronata Desv,Piper betle L1,Actephila m errilliana,Homalium paniculiflorum and Homalium hainanensis.The MTT assay was used to test the antitumor activity of the different extracts of 5 kinds of medicinal plants against four kinds of cancer cells in vitro.Some of the extracts showed remarkable inhibitory activities against the four tumor cells,and expressed dose-ef⁃fect relationship obviously.
medicinal plants;active fractions;anti-tumor activity;MTT assay
R 730.52
A
1674-4942(2011)03-0301-06
2011-04-28
教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-08-0656)
*通讯作者
毕和平