益智油雪花膏对小鼠皮肤光老化的保护作用

刘亚玲，方 翔，石 力，严庆文，冯文婷，张永华，赵春阳，卢圣楼，刘 红，2*

（1.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158；

2.热带药用植物化学省部共建教育部重点实验室，海南 海口 571158）

益智油雪花膏对小鼠皮肤光老化的保护作用

刘亚玲1，方 翔1，石 力1，严庆文1，冯文婷1，张永华1，赵春阳1，卢圣楼1，刘 红1，2*

（1.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158；

2.热带药用植物化学省部共建教育部重点实验室，海南 海口 571158）

讨论了皮肤外用益智油对紫外线（UV）照射引起的小鼠光老化皮肤的影响.实验采用清洁级雌性昆明种小鼠28只，随机分成4组：正常对照组（I组）、模型组（II组）、模型+外涂5%益智雪花膏组（III组）、模型+外涂雪花膏组（IV组），每组7只.模拟日光紫外线长期照射,形成皮肤光老化小鼠模型.用组织切片HE染色，观察皮肤结构改变.以生化分析方法测定羟脯氨酸（HYP）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力以及丙二醛（MDA）的含量.结果表明：与II组相比，III组和IV组的HYP含量、SOD活力明显升高（P＜0.05），MDA含量明显降低（P＜0.05）；与IV组相比，III组的HYP含量、SOD活力较高，MDA含量较低.显微镜观察真皮层，III组和IV组均有不同程度的胶原纤维组织增生及多少不等的炎细胞浸润，但III组纤维细胞分化更为成熟，说明细胞修复功能增强.因此，益智油雪花膏对紫外线照射引起的小鼠皮肤光老化具有保护作用.

益智；雪花膏；皮肤光老化

近年来由于大气臭氧层的破坏，辐射到地球表面的紫外线逐渐增多，由此引起的各种皮肤病明显增多[1].皮肤老化包括两个过程，内在老化（intrinsic或chrondogic aging）和光老化（actinic aging或Pho⁃toaging）[2].前者主要受遗传和代谢等因素的影响，可通过改善自身营养代谢平衡等措施加以防护；后者则主要受长期紫外线照射所致，只能通过避免阳光照射和使用防晒药物来预防，而在实际生活中后者是很难避免的[3].减少自由基的产生、清除老化代谢产物和提高抗氧化酶活性已成为目前延缓皮肤衰老的有效方法[4-6].在中草药中寻找高效、无副作用的天然自由基清除剂的研究已日益成为医药学和日用化学品科学一个十分活跃的研究领域[7-8].

益智（Alpinia oxyphylla）系姜科山姜属多年生草本植物，主要分布在海南澄迈、琼中等地，为海南地道药材之一，也是我国四大南药之一，广东和广西等地区亦有栽培.益智仁为益智的干燥成熟果实，是益智入药的主要部分,分为生品和盐炙品.生品性温味辛，主归脾、肾经，具有温脾止泻，摄唾涎，治疗脾寒泄泻、腹中冷痛、口多唾涎等疾病.盐炙品可缓其辛燥，主入肾经，以补肾缩尿涩精为主，治疗肾虚遗尿、小便频数、遗精白浊等疾病[9].现代药理学研究表明，益智具有神经保护、抗氧化、抗癌症、强心和舒张血管等作用[10].本研究选择清洁级雌性昆明种小鼠为研究对象，建立小鼠光老化动物模型，以益智油雪花膏外用，通过HE染色观察皮肤组织形态学改变，通过羟脯氨酸（HYP）、超氧化物歧化酶（SOD）以及丙二醛（MDA）的的测定分析皮肤胶原含量变化，观察益智油雪花膏抗皮肤光老化的生物学效应.

1 材料和仪器

1.1 实验动物

昆明种小鼠，清洁级，雌性，体重28±2（g），购于广东省医学实验动物中心，合格证号:省科学技术委员会2000A024，省医学实验动管会26-2001A009.

1.2 实验试剂盒

总抗氧化能力试剂盒、HYP试剂盒、SOD试剂盒和MDA试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所.

1.3 益智油的提取

参见文献[11].

1.4 益智油雪花膏的制备[12]

分别称量硬脂酸20.0 g、鲸蜡醇0.5 g、甘油8.0 g、三乙醇胺1.2 g、尼泊金异丙酯0.5 g以及5%的益智油适量于250 mL烧杯中，氢氧化钠0.3 g、去离子水73 mL称量后加入另一250 mL烧杯中.分别加热至90℃，使物料熔化、溶解均匀.装水相的烧杯在90℃下保持20 min灭菌，在搅拌下将水相慢慢加入到油相中，继续搅拌，静置、冷却至室温.

1.5 仪器

紫外线灯管（UVA，40 w，光谱集中在365 nm；UVB，36 w，光谱集中在297 nm，北京电光源研究所）；721可见光分光光度计（上海光学仪器五厂）；800型电动离心机（金坛市富华仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；HPM-500B电子调温电热套（金坛市金南仪器制造有限公司）；TP-214型电子分析天平（丹佛仪器（北京）有限公司）.

2 实验方法

2.1 动物分组

小鼠28只，随机分为4组，每组7只：正常对照组（I组）、模型组（Ⅱ组）、模型+外涂5%益智雪花膏组（Ⅲ组）、模型+外涂雪花膏组（IV组）.

2.2 小鼠光老化模型的建立及其给药方法

参考国内光老化动物模型方法建立动物模型[13-14].照射组动物置于自制鼠盒、丝状盒盖固定,背部暴露.模拟日光照射仪在距光源50 cm处同时进行UVA和UVB照射.每日1次，每次UVA的照射剂量为10 J/cm2；UVB为30 mJ/cm2，平均每次照射时间15 min，连续UV照射共20周.照射前用婴儿剃毛器剃除小鼠背部的绒毛,脱毛范围（2 cm×3 cm），脱毛区给药（Ⅲ组益智雪花膏外用，IV组雪花膏外用，每次Ⅲ组、IV组雪花膏的量相同，照射前预防性涂抹2周）.实验期间每1-2 d对I、Ⅱ、Ⅲ、IV组小鼠进行剃毛处理，使用专用刷子将药物均匀涂布于小鼠的试验区域，照射期间若发现小鼠实验区域发红溃烂，长水泡等情况即停止照射2日.

2.3 皮肤组织切片的制作及HYP、SOD、MDA的测定[15]

20周后，眼眶采血用于测定HYP、SOD、MDA含量.然后处死全部小鼠，立即取下背部脱毛区全层皮肤，1/3皮肤用质量分数10%福尔马林溶液浸泡48 h，石蜡包埋，切片，HE染色，树脂封片.

2.4 统计学处理

3 结果与讨论

3.1 实验期间小鼠状况

实验期间小鼠状况良好，进食正常，体重变化见表1.初期由于剃毛的不适应性，剃毛区域稍有红肿，随着剃毛次数增加，红肿渐渐消失.照射8周半后，发现背部毛发生长缓慢，遂将体毛周期改为每天剃毛一次.14周后部分实验小鼠背部裸露皮肤出现红斑、水疱等现象，停照1-2 d后，该状况消失.

表1 实验小鼠体重变化（±s，n=7)Tab.1The weight change of the experimental mice

表1 实验小鼠体重变化（±s，n=7)Tab.1The weight change of the experimental mice

组别 0周 2周 15周 20周Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组19.26±0.65 20.46±0.56 20.62±1.23 19.82±0.85 28.35±1.62 27.23±1.07 28.06±1.50 28.31±0.98 32.17±1.67 31.80±2.0 32.34±0.56 31.23±1.09 35.21±3.52 34.23±1.20 34.02±2.62 34.52±2.17

3.2 益智油雪花膏对小鼠皮肤组织HYP、SOD、MDA的影响

由表2可知，Ⅱ组小鼠血液与Ⅰ组相比，SOD、HYP活性明显下降，MDA含量增加.Ⅲ组小鼠血液SOD、HYP含量明显高于Ⅱ组，MDA含量低于Ⅱ组.Ⅳ组SOD、HYP含量低于Ⅲ组，MDA含量高于Ⅱ组.Ⅲ组或Ⅳ组小鼠血液的T-AOC、SOD活力显著高于Ⅰ组，MDA含量显著低于Ⅰ组.

表2 益智提取物对小鼠血液HYP含量、SOD水平、MDA含量的影响（±s，n=7)Tab.2 Effects of different treatments on HYP、SOD and MDA in rats

表2 益智提取物对小鼠血液HYP含量、SOD水平、MDA含量的影响（±s，n=7)Tab.2 Effects of different treatments on HYP、SOD and MDA in rats

59.71±0.48 15.72±2.73 43.55±3.07 28.89±1.07Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组2.95±0.95 1.03±0.84 2.14±0.79 1.52±0.42 3.17±0.28 5.89±0.85 3.89±0.37 4.25±0.87

3.3 对与抗光老化有关的细胞的影响

胶原纤维增生与胶原蛋白合成有关，皮肤成纤维细胞合成的蛋白质主要是胶原.

Ⅰ组：复层鳞状层次清晰，真皮内胶原纤维分布均匀，细胞胞浆着色鲜艳，核浆比列无异常，核呈梭形，体积较小，染色细致.

Ⅱ组：真皮内成纤维增生一般，纤维细胞分化成熟，胞浆不丰富，胞核呈梭形，但体积不大，染色细致，间有少量淋巴细胞浸润.

Ⅲ组：复层鳞状上皮真皮内胶原纤维增生明显，纤维细胞分化成熟，胞浆丰富，淡红色，胞核呈梭形，较肥胖，染色质细致，间有少量淋巴细胞浸润.

Ⅳ组：真皮内成纤维增生稍为明显，细胞分化成熟，胞浆丰富，胞核呈梭形，染色细致，间有少量淋巴细胞浸润.

图1 Ⅰ组Fig.1Normal control

图2 Ⅱ组Fig.2Photoaging mode

图3 Ⅲ组Fig.3Model plus Miquel

图4 Ⅳ组Fig.4Model plus cream

经益智雪花膏涂抹及未经涂抹紫外线照射的小白鼠真皮层均有不同程度的胶原纤维组织增生及多少不等的炎细胞浸润，纤维细胞分化成熟.

4 结论

本实验通过建立小鼠光老化模型，发现光老化组小鼠皮肤SOD活力降低，提示抗氧化能力下降，羟脯氨酸含量降低，说明细胞的胶原含量减少，并且细胞氧化程度增加，MDA含量增加，说明细胞氧化程度增加，纤维细胞增生，说明胶原蛋白合成活跃.而在预先用5%益智雪花膏保护的细胞各种改变均受到了明显的抑制，比用等量纯雪花膏涂抹的细胞抑制作用更为明显，结果显示益智抗皮肤光老化具有一定作用，这也为益智在美容医疗界的应用提供了新的借鉴与视野.

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Protective Effec of Topical Use of Miquel Oxyphylla Cream on Photoaging Skin in Mice

LIU Yaling1，FANG Xiang1，SHI Li1，YAN Qingwen1，FENG Wenting1，ZHANG Yonghua1，ZHAO Chunyang1，LU Shenglou1，LIU Hong1，2＊
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China；
2.Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，Haikou571158，China）

To investigate the influence of topical use of Miquel oxyphylla cream on the ultraviolet（UV）radiation in⁃duced photoaging skin in mice.Twenty-eight female mice were randomly divided into four group of normal control(group I),photoaging mode（groupⅡ）,model plus Miquel oxyphylla-5%cream（groupⅢ）and model plus cream（group IV）with 7 mice each.The mouse model of photoaging skin was established by long-term UV radiation.Histologi⁃cal sections stained with HE,and the structural changes in skin was observed.HYP,SOD,MDA in the murine skin were detected by biochemical method.The result showed that Compared with groupⅡ,HYP,SOD in groupⅢand group IV increased significantly（P＜0.05）,MDA decreased significantly（P＜0.05）.Compared with group IV,HYP,SOD in groupⅢwere higher than that of in group IV,the content of MDA was lower than that of in group IV.There were obvious fibro⁃blasts hyperplasia in groupⅢand group IV,but the fiber cell of groupⅢdifferentiated more mature.That indicates the repair function of groupⅢwas stronger than group IV.Miquel oxyphylla cream has a protective effect against photoaging.Key words:Miquel oxyphylla；cream；photoaging

TQ 65

A

1674-4942（2011）04-0425-04

2011-10-15

国家大学生创新性实验计划（101165817）

*通讯作者

毕和平