Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4在胰腺导管腺癌中的表达及其与E-cadherin的相关性研究

李东哲，赵梅芬，宋少伟，郭克建

（中国医科大学附属第一医院普通外科教研室，胰腺外科，沈阳110001）

TMPRSS4（Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4）是新近发现的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白家族中的一员，在胰腺癌、甲状腺癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤组织中表达增高，其与肿瘤细胞的增殖、浸润和转移相关［1，2］。上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）是一种维持细胞间连接的钙粘附素家族中的重要成员。目前其减少或缺失被认为是发生上皮细胞向间质细胞的转变（epithelial-to-mesenchymaltransitions，EMT）的标志性事件［3］。胰腺癌中TMPRSS4表达与E-cadherin表达的关系目前罕见报道，我们对胰腺癌组织进行了上述2种蛋白表达情况的检测，并对2者表达的相关性及其与胰腺癌病理学特点进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

54例胰腺导管腺癌标本取自中国医科大学附属第一医院2005年1月至2009年10月收治并行手术切除治疗的原发性胰腺癌标本，男性34例，女性20例；年龄39～74岁，平均年龄56.9岁。所有病例均经术中及术后病理证实为胰腺导管腺癌，其中有淋巴结转移者18例。取4例正常胰腺组织（胰腺良性肿瘤手术时所取胰腺组织）作为对照。另取16例胰腺导管腺癌及配对癌旁组织（距离肿瘤1.5～2.0 cm）行 Western blot检测 TMPRSS4和E-cadherin蛋白表达。

1.2 方法

1.2.1 蛋白免疫印迹法（Western blot）：变性后的蛋白以SDS-PAGE胶（5%浓缩胶，10%分离胶）进行分离，湿转，基因公司凝胶成像系统扫描，使用Quantity One软件对扫描图像进行分析。TMPRSS4多克隆抗体购于Protein Tech公司；E-cadherin多克隆抗体购于Santa Cruz公司，内参使用碧云天试剂公司β-actin。

1.2.2 免疫组织化学染色：所有标本采用链霉素亲和素—过氧化酶复合物法（SP法）进行免疫组织化学染色，DAB显色。TMPRSS4多克隆抗体购于Protein Tech公司，E-cadherin多克隆抗体购于Santa Cruz公司。PBS替代一抗做为阴性对照。TMPRSS4与E-cadherin定位于细胞膜。结果判断：TMPRSS4染色强度：淡黄色（+），黄色（++），棕或褐黄色（+++）。阳性判断标准为染色细胞≥20%为阳性，染色细胞＜20%为阴性。E-cadherin染色分级标准参照Jawhari等［4］方法：以正常胰腺或癌周残存正常胰腺组织中E-cadherin染色情况为阳性对照，细胞染色完全正确消失为0分；癌细胞质表达为1分；癌细胞染色一致性降低或灶性降低为2分；癌细胞与正常胰腺组织染色相同为3分。0、1、2分为表达缺失“－”，3分为正常表达“＋”。

1.3 统计学分析

应用SPSS13统计学软件，计量资料用t检验，计数资料用χ2检验和Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌与癌旁组织中TMPRSS4与E-cadherin的蛋白表达

Western blot结果示，E-cadherin在胰腺癌的表达水平为0.489±0.21，配对癌旁组织中的表达水平为1.108±0.258，2者比较差异有统计学意义（P<0.01）；TMPRSS4蛋白在胰腺癌中的表达水平为1.223±0.125，配对癌旁组织中的表达水平为0.667±0.106，2者比较差异有统计学意义（P<0.01）（图1）。

免疫组织化学染色结果示TMPRSS4蛋白定位于细胞膜上，TMPRSS4在54例胰腺癌组织中有37例阳性表达，表达率为68.5%，在出现转移的淋巴结中亦发现其表达阳性（图2）；E-cadherin蛋白也定位于细胞膜上，正常胰腺组织全部有表达，在54例胰腺癌组织中35例出现了表达缺失，表达缺失率为64.8%。

2.2 胰腺癌中TMPRSS4与E-cadherin的蛋白表达病理特征的关系

在35例中低分化胰腺癌中28例（80%）TMPRSS4蛋白的表达呈阳性，27例E-cadherin蛋白表达缺失；18例出现淋巴结转移的胰腺癌中16例（88.9%）呈TMPRSS4阳性，16例E-cadherin蛋白表达缺失；在32例Ⅱ、Ⅲ期胰腺癌中28例（87.5%）呈阳性表达，26例E-cadherin蛋白表达缺失。

2.3 TMPRSS4与E-cadherin在胰腺癌组织中表达的相互关系

在37例TMPRSS4蛋白表达阳性的胰腺癌组织中有29例E-cadherin蛋白表达缺失，正常表达有8例。而在17例TMPRSS4蛋白表达阴性的胰腺癌组织中有6例E-cadherin蛋白表达缺失，正常表达有11例。TMPRSS4与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.419，P=0.002）。

3 讨论

目前认为上皮型钙黏蛋白的减少或缺失是出现EMT的标志性变化［5，6］。缺失上皮型钙黏蛋白的细胞呈现许多非上皮细胞的特征，如极性丢失，并引起细胞间的相互作用减少，诱导特定的转录因子产生从而导致肿瘤转移。在肺癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等上皮癌中检测到了E-cadherin基因的突变或者蛋白水平的下调［7，8］。Tamer等［3］研究发现肿瘤细胞E-cadherin的缺失会诱导产生多种转录和功能上的的改变，从而引起肿瘤细胞转移扩散。本研究显示E-cadherin的表达缺失与肿瘤的分化、淋巴结有无转移和临床分期相关，表明E-cadherin的表达异常在胰腺癌的侵袭和转移中同样起着重要作用。

TMPRSS4是新近发现的一种跨膜丝氨酸蛋白酶，到目前为止已发现在胰腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌、肺癌中均呈高表达［1，2，9，10］。在以上癌组织中TMPRSS4的表达明显高于癌旁组织。体外细胞研究证明，TMPRSS4在肿瘤细胞的增殖、浸润、迁移、转移中起着重要作用［2］。在结肠癌的研究中发现TMPRSS4的表达的增高与肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及临床分期密切相关［9］。我们的研究提示在胰腺癌中TMPRSS4同样与肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及临床分期密切相关。这些说明胰腺癌的浸润、转移中TMPRSS4可能起着重要的作用。

我们在蛋白免疫印迹实验中证实TMPRSS4在胰腺癌中高表达，而E-cadherin与其相反，以癌旁组织高表达为主，免疫组织化学染色结果示在胰腺癌中两者表达呈负相关，这与Jung［2］的实验结果相符。Jung等在结肠癌细胞研究中发现，TMPRSS4在结肠癌细胞中使E-cadherin调控的细胞间相互作用缺失，引起EMT，从而增强浸润性，说明TMPRSS4通过EMT引起癌细胞的浸润、迁移和转移。我们的实验结果提示在胰腺癌中TMPRSS4可能也通过EMT引起胰腺癌的转移。在胰腺癌转移中2种蛋白是否有直接的关系，或是有其他因子参与，有待于进一步研究阐明。

鉴于2种蛋白表达情况与胰腺癌分化程度、淋巴转移和临床分期有着明显相关，我们认为联合检测2种蛋白对胰腺癌恶性度判断有帮助。目前对TMPRSS4在胰腺癌中的功能研究并不多见，进一步的研究将有助于揭示胰腺癌浸润、转移的机制。

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［10］Kebebew E，Peng M，Reiff E，et al.ECM1 and TMPRSS4 are diagnostic markers of malignant thyroid neoplasms and improvet he accuracy of fine needle aspiration biopsy ［J］.Ann Surg，2005，242（3）：353-355.