红酵母细胞通透性研究

李永红， 朱登勇， 王 姣， 侯立芬， 刘宏民

(1.郑州大学 新药研究开发中心 河南 郑州 450001； 2.郑州大学 药学院 河南 郑州 450001；3.郑州大学 化学系 河南 郑州 450001)

红酵母细胞通透性研究

李永红1,2， 朱登勇3， 王 姣3， 侯立芬3， 刘宏民1,2

(1.郑州大学 新药研究开发中心 河南 郑州 450001； 2.郑州大学 药学院 河南 郑州 450001；3.郑州大学 化学系 河南 郑州 450001)

用插入式超声、反复冻融和有机溶剂法对细胞通透性进行处理.结果表明，在超声功率为750 W，超声时间3 s和间隔时间4 s的条件下，超声处理75次效果最佳；加入甲苯、氯仿和正己烷等有机溶剂均可提高细胞通透性，其中甲苯的效果最好.

红酵母； 细胞通透性； 超声； 反复冻融； 有机溶剂

0 引言

在生物转化过程中，如果所用的酶是胞内酶，细胞的通透性在很大程度上影响转化率.改变细胞膜的通透性有利于代谢产物在细胞外(培养基中) 的累积，使代谢朝着人们希望的方向进行.

用固定化细胞进行生物转化具有显著的优越性.但固定化以后，细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用，增大细胞膜通透性可以减小细胞膜、细胞壁的扩散限制作用，提高转化速度.常用于改变细胞通透性的方法有超声法、反复冻融法和有机溶剂法[1-8].

作者在实验中筛选到一株能产生立体选择性脂肪酶的红酵母[9]，利用其建立了生物拆分法制备S-倍他洛尔的新工艺[10]，并对细胞固定化进行研究，为了提高固定化细胞的转化速率，需要对细胞的通透性进行研究.

1 材料与方法

1.1仪器

超声波细胞粉碎机JY92-Π型(宁波新芝科器研究所)，恒温摇瓶柜HYG-Ⅱa型(上海欣蕊自动化设备有限公司)，薄层扫描色谱仪CS-930型(岛津公司)，YJ超净工作台(苏州市洁净工作研究所)，pH计(上海精密科学仪器有限公司)，Syltech 500高效液相色谱仪(浙江大学智达信息工程有限公司)，Chiralcel OJ-H色谱柱(Dicel 公司).

1.2材料与试剂

菌种为本实验室筛选并保藏的一株胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198.

玉米浆由安阳第一制药厂提供；氯仿、乙酸乙酯由工业品重蒸得到；琼脂粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、丙酮及其他试剂均为分析纯.

1.3细胞的培养与处理

1.3.1细胞培养 培养基配方为：蛋白胨为0.2%，玉米浆为2%，甘油为3%，pH 5.7.接种后于32 ℃，210 r/min培养40 h.

1.3.2超声处理[7]将红酵母细胞分装入锥形瓶中，加入已灭菌的pH 6.0缓冲溶液，用不同超声功率及不同超声次数(超声条件：超声时间3 s，间隔时间4 s)进行处理(超声处理在冰水浴中进行).以不作任何处理的细胞作为空白对照.

1.3.3反复冻融处理[4-5]将红酵母细胞置于冰箱中-85 ℃冻存10 min，取出，30 ℃水浴融化，反复冻融三次，置于冰箱4 ℃保存.以不作任何处理的细胞作为空白对照.

1.4生物转化

1.4.1水相中转化 在处理好的细胞悬液中加入3 g/L的底物，于28 ℃，210 r/min进行转化，间隔一定时间取样.

1.4.2两相体系中转化 将缓冲液分装到三角瓶中，灭菌后加入3 g/L底物及适量有机溶剂，将离心过的细胞平均分至各瓶，于28 ℃，210 r/min进行转化.

1.5转化产物分析

转化产物用TLC[11]和HPLC[12]方法进行分析.改变细胞通透性是为了增大底物的转化速率，所以用转化率来判断细胞通透性的好坏.转化率高即表示细胞通透性好.

1.5.1转化产物的提取 用等体积的乙酸乙酯萃取转化液三次，将乙酸乙酯相用饱和NaHCO3溶液洗三次，饱和NaCl溶液洗三次，再用蒸馏水洗一次.饱和NaHCO3相和饱和NaCl相用乙酸乙酯反萃取一次.合并有机相，用无水Na2SO4干燥后用于HPLC法测定.

1.5.2转化产物的测定 采用HPLC方法检测转化产物浓度，以手性Chiralcel OJ-H柱为固定相，正己烷-异丙醇(体积比85∶15)为流动相，检测波长273 nm.并在此基础上计算转化率.由于化合物Ⅱ是目标产物(图1)，所以以化合物Ⅱ的量占加入底物量的百分率来表示转化率.

图1 药物中间体拆分原理示意图Fig.1 Scheme of drug intermediate resolution

生物转化和其他酶促反应一样符合米氏曲线，所以，应该研究在米氏曲线上处于一级反应阶段时的转化率，因此在研究超声影响时选择转化30 min时的转化率.而研究有机溶剂影响时由于反应体系不同，也对不同体系的转化曲线进行了研究.

2 结果与讨论

图2 不同条件超声处理细胞的转化曲线Fig.2 Conversion by cells treated by different ultrasonic conditions

2.1插入式超声对细胞通透性的影响

不同条件超声处理后的转化结果如图2所示.

由图2可以看出，功率为400 W时，超声60和75次时转化率较高，与空白对照相当；功率为500 W时，超声75次转化率比空白对照高，90次时与空白对照相当；功率为600 W时，超声次数从60次开始，转化率都要比空白对照高；功率为750 W时，超声60次以上转化率都要比空白对照好，超声75次已明显高于空白对照.结论：随着超声次数的增加，转化率呈先升后降的趋势，超声75次时转化率最高；随超声功率的增加，转化率呈不断增加的趋势(见表1).

表1 超声次数为75次时各个功率下的转化率

产生上述结果的可能原因是：①功率相同时，超声处理次数不同使细胞受损产生的渗漏程度以及酶活性受到的影响不同.随着超声次数增多，酶蛋白活性受损，但细胞通透性提高，这两种作用对转化率产生相反的影响，处理75次转化率最高是这两种因素共同作用的结果.②酵母菌为真菌，细胞壁比较坚韧，必须在大功率条件下才能达到较好的渗漏效果，因此本研究中在750 W功率下效果最明显，如果提高功率效果可能更好.

2.2有机溶剂对细胞通透性的影响

研究有机溶剂的影响需要以水相中的转化结果为参照.水相中的转化曲线如图3所示.由图3可知，反应体系中没有加入有机溶剂时转化速度很慢，最高速率为0.075/h，反应6 h达到最高转化率45%.

2.2.1氯仿对转化的影响 在氯仿-水双相体系中转化时的转化曲线如图4.由图4可知，反应体系中加入氯仿后，最高转化速率为0.078/h，反应3 h转化率达到56%，以后随时间变化不明显.

图3 水相中的转化曲线Fig.3 Conversion in aqueous phase

图4 在氯仿-水双相体系中的转化曲线Fig.4 Conversion in aqueous-chloroform double phase

2.2.2正己烷对转化的影响 正己烷-水双相体系中的转化曲线如图5.由图5可以看出，反应体系中加入正己烷后，反应3 h转化率基本达到最大值61%，最高速率为0.058/h.

2.2.3甲苯对转化的影响 甲苯-水双相体系中的转化曲线如图6.由图6可知,反应体系中加入甲苯后，反应1 h产物转化率就达到66%，最高速率为0.27/h.这是由于加入甲苯后细胞的通透性发生改变，酶与底物可以充分接触，从而提高了底物的转化速率.

由图3～6可以看出：体系中不加有机溶剂，反应速度很慢，加入有机溶剂能够使反应效率迅速提高，其中甲苯效果最好.表2为不同体系的转化效果比较.

图5 在正己烷-水双相体系中的转化曲线Fig.5 Conversion in aqueous-hexane double phase

图6 在甲苯-水双相体系中的转化曲线Fig.6 Conversion in aqueous-toluene double phase

表2 各溶剂中底物的最高转化速率

进一步对甲苯用量进行了研究，结果如图7.由图7可知，甲苯加入量小于15%时，转化速率随甲苯量的增加而提高；当加入量大于15%时，影响不明显.

图7 体系中甲苯含量对转化的影响Fig.7 Effect of toluene content on conversion

2.3反复冻融对细胞通透性的影响

细胞反复冻融三次后，转化结果和空白几乎相同.

3 结论

经过对不同方法的研究得出以下结论：

1)超声处理能提高细胞通透性.随着超声次数的增加，转化率呈先升后降的趋势，超声75次时转化率最高；功率小于750 W时效果随功率的增加而提高.

2)反复冻融对细胞通透性的影响不明显.

3)甲苯、氯仿、正己烷等有机溶剂均可提高细胞的通透性，其中甲苯的效果最好.

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StudyontheCellularPermeabilityofRhodotorula

LI Yong-hong1,2, ZHU Deng-yong3, WANG Jiao3, HOU Li-fen3, LIU Hong-min1,2

(1.NewDrugResearch&DevelopmentCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;2.SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;3.DepartmentofChemistry,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Probe ultrasound,repeated freeze thawing and organic solvents were used to increase cellular permeability. It was discovered that the best result was obtained with supersonic power 750 W,supersonic time 3 s,time interval 4 s,and the supersonic times 75. Toluene,chloroform and n-hexane could increase cellular permeability,with toluene the best.

rhodotorula;cellular permeability;ultrasonic;repeated freeze-thaw;organic solvent

Q 932

A

1671-6841(2011)04-0100-04

2010-12-08

李永红(1970-)，女，副教授，博士，主要从事生物学研究，E-mail:lyh224@163.com；通讯作者：刘宏民(1960-)，男，教授，博士，主要从事药物化学研究，E-mail:liuhm@zzu.edu.cn.