酶法制备乳源抗菌肽的抗菌性研究

陈娅娇

（蒙牛（乳业）股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010000）

随着抗生素的广泛应用，耐药菌株逐年增多，目前金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药菌株高达90%以上，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphyrlococcus aureus，MRSA）已经成为医院内感染最常见的致病菌[1-4]。有些细菌甚至产生多重耐药，如致病性大肠埃希菌约40%的菌株对链霉素、氯霉素、四环素等多种抗生素产生耐药性；铜绿假单胞菌对许多抗生素具有天然或获得耐药性，这给临床治疗带来极大的困难，如何有效防治细菌感染及控制细菌耐药性的产生与播散是一项长期、复杂、艰巨的任务，因而寻找和研制有效的抗菌药物非常必要。抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物体天然免疫防御的重要组成部分，多数是一类相对分子量小于10 ku，由20～60个氨基酸残基组成[5-7]。链长、序列及结构是多样性的阳离子型两亲性肽类。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽的制备方法主要有如下4种:从动植物组织中直接提取法、化学合成法、基因工程法和酶解法。由于酶作用本身的特点和固定化酶技术的应用,酶解法具有成本低、安全性好、对设备条件要求不高、便于工业化生产等优点,因而Bolscher等认为酶解蛋白质可能是大批量生产抗菌肽最有前途的方法。鉴于胰蛋白酶水解牛乳后产物中的抗菌肽具有高抗菌性,对G-、G+菌均有抑菌作用,且MIC值与乳酸链球菌肽（nisin）的抑菌作用相当，为获得具有广谱抗菌活性的抗菌肽，本实验以大肠杆菌（escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（staphy－lococcus aureus）、产气芽孢杆菌（aer osis germ bacillus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、黑曲霉（aflatoxicosis）为实验菌，在预备实验确定的胰蛋白酶水解条件下研究了乳源抗菌肽抑菌活性的影响[8-11]。本文采用琼脂扩散法和试管连续稀释法进行体外抑菌实验及最低抑菌浓度（MIC）的测定，以探讨乳源抗菌肽对常见致病菌和条件致病菌的体外抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料来源

菌株来源为金黄色葡萄球菌（ATCC25923），乙型溶血性链球菌（ATCC25921），大肠埃希菌（ATCC25922），福氏志贺氏菌（ATCC27891）：由湖北工业大学生物工程学院提供。乳源抗菌肽液：由湖北工业大学膜技术研究所提供；乙醇，DPPH溶液，PBS溶液，硫酸亚铁，三氯醋酸，亚硝酸钠，硝酸铝，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 乳源抗菌肽的制备

将脱脂奶粉配成10%的溶液，调节pH至8.0，按酶与底物之比为0.025的比例加入胰蛋白酶，在37℃恒温水浴，酶解15 min，然后用沸水浴灭酶活5 min，离心（10000 r/min）15 min，收集上清液。将所得上清液用小型超滤系统进行分离，取5 ku～10 ku的肽段经冷冻真空干燥备用[12]。

1.2.2 菌液的制备

将金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、福氏志贺氏菌接种于普通琼脂平板上，置37℃温箱中培养18 h，用无菌生理盐水配成每毫升相当于3亿的菌浓度（金黄色葡萄球菌配成每毫升相当于9亿的菌浓度[13]。

1.2.3 琼脂扩散法

用无菌棉签沾取菌液在普通琼脂平板上作均匀密集划线，待菌液干燥后，用外径5 mm的打孔器打孔，每孔加药液200 μL，平放在37℃温箱中培养24 h观察结果，测量抑菌圈直径。抑菌圈直径取两次实验结果的平均值[14]。

1.2.4 试管连续稀释法

根据抑菌实验的结果，测定乳源抗菌肽溶液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。取小号试管6支，编号。第一步每支管各加1 mL肉汤培养基。然后在第1管加1 mL药液，用吸管在第1管吹吸数次，使药液与肉汤培养基混匀，取出1 mL加于第2管，混匀取出1 mL加于第3管，如此稀释至第5管弃去1 mL，第6管不加药液作为对照。第三步每管加菌液50 μL，混匀，置37℃温箱中培养24 h。然后从每管中取出一接种环接种于普通琼脂平板上，再继续培养24 h，观察结果。以无细菌生长的最高稀释浓度为该药液的最低抑菌浓度。

1.3 抑菌方法

1.3.1 混合菌液的制备

将金黄色葡萄球菌，乙型溶血性链球菌，大肠埃希菌，福氏志贺氏菌混合在一起,然后稀释配制成10个/mL的菌悬液，菌液按0.2 mL/平板（平板直径为60.0 mm）的量均匀涂于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，再贴上无菌圆形滤纸（直径为6.0 mm），在各纸片上分别滴加20 L抗菌肽溶液，4℃静置3 h，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径。

1.3.2 单一性菌种溶液的制备

将金黄色葡萄球菌，乙型溶血性链球菌，大肠埃希菌，福氏志贺氏菌分别配制成10个/mL的菌悬液，菌液按0.2 mL/平板（平板直径为60.0 mm）的量均匀涂于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，再贴上无菌圆形滤纸（直径为6.0 mm），在各纸片上分别滴加20 L抗菌肽溶液，4℃静置3 h，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径。

1.4 测定乳源抗菌肽对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、福氏志贺氏菌的最小抑菌浓度

配制浓度P分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL的乳源抗菌肽溶液，按1.3的方法进行抑菌实验，取抑菌圈最小时的浓度为最小抑菌浓度。

2 抑菌性研究结果

配制不同浓度的乳源抗菌肽溶液，其抑菌圈大小与浓度的关系如图1所示。

图1 乳源抗菌肽的浓度和抑菌圈直径的对应关系Fig.1 Milk-derived antimicrobial peptide concentration and the corresponding relationship between inhibition zone diameter

配制不同浓度的乳源抗菌肽溶液，铺于培养皿上，菌落数与乳源抗菌肽溶液浓度关系如表1和表2所示。

表1 乳源抗菌肽对混合菌液的抑制情况Table 1 Milk-derived antimicrobial peptides in the inhibition of the mixed bacterial suspension

表2 乳源抗菌肽对单独菌种溶液的抑制情况Table 2 Milk-derived antimicrobial peptides on the inhibition of a single bacterium

3 结论

1）乳源抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.125μg/mL，对乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、福氏志贺氏菌的最小抑菌浓度为0.25μg/mL；当乳源抗菌肽的浓度为0.5μg/mL时,对金黄色葡萄球菌，乙型溶血性链球菌，大肠埃希菌，福氏志贺氏菌混合在一起的浓度为10个/mL的菌溶液有很好的抑菌效果。

2）实验结果表明，乳源抗菌肽提取物对金黄色葡萄球菌，乙型溶血性链球菌，大肠埃希菌，福氏志贺氏菌有明显的抗菌活性，但对金黄色葡萄球菌的抗菌活性强于大肠埃希菌，这可能是乳源抗菌肽的有效成分对不同病原菌的作用机理不同所致。由于乳源抗菌肽粗提物中含有多种化学成分，成分与药理作用复杂，并且受多种因素的影响，本文只做了乳源抗菌肽的粗提液，有关乳源抗菌肽有效成分的提取与分析有待进一步研究。

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