桑椹总多酚的提取工艺研究

2011-12-01 07:26李巨秀张朝红房红娟魏江华
食品研究与开发 2011年9期
关键词:桑椹定容恒温

李巨秀,张朝红,房红娟,魏江华

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院,陕西 杨凌 712100)

桑椹(Mublberry),又称桑枣、桑果,为桑科桑属植物桑(Morass alba L.)的成熟聚花果[1-3]。桑椹中含有丰富的多酚类化合物,主要是矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香苷为主的花青素类[4-5]。而花色苷不仅可作为食品天然着色剂,也是一种重要的抗氧化剂,具有显著的自由基清除能力,抑制脂质过氧化(Lipid Peroxidation)和低密度脂蛋白氧化(LDL Oxidation),降低细胞中活性氧的水平,具有预防和治疗一些慢性流行病(chronic diseases)的生理功能,如癌症、神经退化性疾病、炎症以及心血管疾病[6-10]。

乙醇由于其成本低、毒性小、易回收等特点,成为提取多酚化合物最常用的试剂[11]。本试验以桑椹果为试验材料,以乙醇溶液为提取剂,通过单因素试验和正交试验,分别研究乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、提取pH对桑椹总多酚得率的影响,为桑椹资源的开发以及桑椹产品功能特性的评价奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 材料

桑椹:由西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所提供。2009年5月采摘,将刚采摘的成熟鲜桑椹,用清水洗净后在自然阴凉处沥干水分,每2 kg分装在一袋,在袋中放入一包冷冻剂,存入-40℃冰箱中,备用。

1.1.2 主要试剂

Folin试剂:上海喜润化学工业有限公司;没食子酸:科邦生物有限公司;无水碳酸钠、无水乙醇、盐酸:均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

UV-1240紫外分光光度计:日本岛津公司;BFM-GBI贝利粉碎机:济南贝利粉技术工程有限公司;KDC-40低速离心机:科大创新股份中佳分公司;R-200旋转蒸发仪:瑞士步琪公司;HH-S6电热恒温水浴锅:北京科伟永兴仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹总多酚的分析方法

用福林酚法测定桑椹多酚类化合物含量。

1.3.1.1 标准曲线的制作

用10mL蒸馏水溶解0.05g没食子酸,定容至500mL,分别移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL到100 mL容量瓶中,各加入50 mL蒸馏水,加入福林酚试剂1 mL后摇匀,静置4 min~5 min,加入15% 的Na2CO3溶液2 mL,用蒸馏水定容,置于25℃的恒温水浴锅中60 min反应。将反应显色后的样品溶液,置于分光光度计波长为760 nm下测定吸光光度值。以吸光度值为纵坐标,以没食子酸浓度为横坐标绘制曲线。所得到的线性方程为y=0.0811x,R2=0.9986,y为吸光度,x为没食子酸浓度(μg/mL)。

1.3.1.2 样品测定

取提取的桑椹样品1 mL加入到100 mL容量瓶中,加入50 mL蒸馏水振荡摇匀,加入Folin酚试剂1 mL摇匀,静置约4 min~5 min,加入15% 的Na2CO3溶液2 mL,混匀后用蒸馏水定容至刻度,置于25℃的恒温水浴中反应60 min,在760 nm波长下测定吸光度,在标准曲线上查出所对应的多酚含量,然后根据公式(1)计算桑椹多酚的得率。

式中:M为桑椹多酚的得率;μg/g,A为吸光度;N为稀释倍数;m为样品质量,g。

1.3.2 桑椹总多酚提取的单因素试验

以桑椹总多酚得率为评价指标,分别对乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、提取pH进行单因素试验,以确定各因素对桑椹总多酚提取效果的影响和适宜的范围。所有处理均进行3次重复试验。

1.3.3 桑椹中总多酚提取的正交试验

在单因素试验的基础上,以提取浓度(A)、提取料液比(B)、提取时间(C)、提取温度(D)、提取酸度(E)为影响因素,以桑椹总多酚得率为指标,选用L16(45)正交试验设计表,优化提取工艺参数,做两次重复试验。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of L16(45)orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 桑椹多酚提取单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g,按料液比为1:10(g/mL)比例分别加入pH为5的0%、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液后迅速密封,在60℃恒温水浴中提取1 h。提取结束后用纱布进行粗过滤,然后将粗滤液在3000 r/min下离心10 min,将上清液完全转入100 mL容量瓶,定容后测定,结果见图1。

图1 乙醇浓度对桑椹多酚提取的影响Fig.1 Influences of ethanol concentration on yield of total polyphenols from mulberry

从图1中可以看出,随着乙醇浓度增大,提取的桑椹多酚得率随之增大。在乙醇浓度为60%时,总多酚得率达到最大值,而随着乙醇浓度进一步增大,多酚得率开始下降,下降到一定值后,在乙醇浓度为80%时,趋于平缓,得率变化减小。故选取乙醇浓度为60%作为进一步试验的总多酚提取剂。

2.1.2 料液比对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g,分别取料液比(g/mL)为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,以pH为5的60%乙醇溶液为提取溶剂,密封后在60℃的恒温水浴中提取1 h。提取结束后将提取液用纱布粗过滤,再将粗滤液在3000 r/min下离心10 min,将上清液完全倾入100 mL容量瓶,定容后测定,分析结果见图2。

从图2中可以看出,当随着料液比(g/mL)比例增大时,桑椹总多酚得率随之增大。在料液比(g/mL)为1∶15时,桑椹多酚得率达到最大值,而随着料液比(g/mL)比例逐步增大时,得率开始下降,当从料液比(g/mL)为1∶20至1∶30之间时,总多酚得率变化较小。所以选取提取料液(g/mL)比为1∶15时较适宜。

图2 料液比对桑椹总多酚得率的影响Fig.2 Influences of ratio of mulberry to ethanol on yield oftotal polyphenols from mulberry

2.1.3 提取时间对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g,按料液比(g/mL)1∶10比例加入pH为5的60%乙醇,在60℃的恒温水浴分别提取30、60、90、120、150、180、210 min,结束后将提取液用纱布粗过滤,粗滤液在3000 r/min下离心10 min,将上清液完全倾入100 mL容量瓶,定容后测定,结果见图3。

图3 提取时间对桑椹多酚提取的影响Fig.3 Influences of extraction time on yield of total polyphenols from mulberry

从图3中可以看出,当提取时间增大时,总多酚得率没有显著变化。当提取时间达到120 min时,桑椹多酚得率值达到最大。随着提取时间的延长,总多酚得率有所下降。若提取时间过长,不仅杂质溶出较多,同时使得多酚化合物长时间受热分解损失,因此确定提取时间为120 min较为适宜。

2.1.4 提取温度对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g,按料液比(g/mL)1∶10比例加入pH为5的60%乙醇溶液,分别在温度为20、30、40、50、60、70、80℃提取1 h。提取结束后提取液用纱布粗过滤,粗滤液在3000 r/min下离心10 min,将上清液完全倾入100 mL容量瓶,定容后测定,结果见图4。

从图4中可以看出,随着提取温度升高时,总多酚得率迅速上升。在提取温度为60℃时,桑椹总多酚得率达到最大,若提取温度增高,多酚得率又开始迅速下降,这可能与多酚化合物的热不稳定性有关,因此选定提取温度为60℃为宜。

2.1.5 提取pH对桑椹多酚提取的影响

图4 提取温度对桑椹多酚提取的影响Fig.4 Influences of temperature on filed of total polyphenols from mulberry

取桑椹样品2 g,按料液比(g/mL)为1∶10比例加入不同pH的60%乙醇,pH分别为2、3、4、5、6、7,在60 ℃的恒温水浴中提取1 h。提取结束后提取液用纱布粗过滤,粗滤液在3000 r/min下离心10 min,将上清液完全倾入100 mL容量瓶,定容后测定,结果见图5。

图5 提取pH对桑椹多酚提取的影响Fig.5 Influences of pH value on field of total polyphenols from mulberry

从图5中可以看出,当随着提取酸度减小即pH增大时,桑椹总多酚得率随之增大,并且在提取溶剂pH为4时,得率达到最大值。而随着提取溶剂pH增大,提取量值又开始迅速下降。故溶剂的pH为4时提取效果较好。由于在中性及碱性pH下都会破坏多酚化合物的结构,导致其损失。因此,一般在酸性条件下可以保护多酚化合物,从而提高提取得率。

2.2 桑椹多酚提取工艺的优化

在以上单因素试验的基础上,以桑椹总多酚得率为指标,采用五因素四水平正交试验方案对提取工艺参数进行优化,考察乙醇浓度、提取料液比、提取时间、提取温度以及提取溶剂pH桑椹总多酚得率的影响。正交试验设计及结果见表2。方差分析结果见表3。

由极差分析可以看出(表2),5个因素对多酚提取效果影响的主次顺序为:A>C>D>B>E,即提取溶剂浓度>提取时间>提取温度>提取料液比>提取pH。试验所得最佳优化工艺组合为A3B3C3D4E2,即乙醇为65%、料液比1∶15(g/mL)、提取时间120 min、提取温度65 ℃、提取为pH为4。

从表3方差分析可知,乙醇浓度和提取时间对桑椹总多酚得率在α=0.01水平上有极显著的影响,料液比、提取温度和pH在α=0.05水平上对桑椹总多酚得率均有显著的影响。

表2 桑椹总多酚的提取正交试验方案及结果Table 2 Results of the orthogonal experiment of extraction total polyphenol from mulberry

表3 正交设计方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

由于得到的优化组合不在正交试验组合中,对优化组合进行了2次重复验证试验,经分析,桑椹总多酚得率为6709μg/g,说明该工艺可行。

3 结论

在单因素试验基础上,采用正交试验设计对其桑椹总多酚提取工艺进行优化,得到优化的提取工艺参数为:乙醇浓度为65%、料液比为1∶15(g/mL)、提取时间为120 min、提取温度为65℃、提取的pH为4。在此条件下总多酚的提取含量是6709μg/g。

通过极差分析和方差分析,影响桑椹总多酚提取效果的因素主次顺序为提取溶剂浓度>提取时间>提取温度>提取料液比>提取酸度,并且乙醇浓度和提取时间在0.01水平上对桑椹总多酚的提取有极显著的影响,料液比、提取温度和pH在0.05水平上对桑椹总多酚的提取有极显著的影响。

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