桑椹总多酚的提取工艺研究

李巨秀，张朝红，房红娟，魏江华

（西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

桑椹（Mublberry），又称桑枣、桑果，为桑科桑属植物桑（Morass alba L.）的成熟聚花果[1-3]。桑椹中含有丰富的多酚类化合物，主要是矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香苷为主的花青素类[4-5]。而花色苷不仅可作为食品天然着色剂，也是一种重要的抗氧化剂，具有显著的自由基清除能力，抑制脂质过氧化（Lipid Peroxidation）和低密度脂蛋白氧化（LDL Oxidation），降低细胞中活性氧的水平，具有预防和治疗一些慢性流行病（chronic diseases）的生理功能，如癌症、神经退化性疾病、炎症以及心血管疾病[6-10]。

乙醇由于其成本低、毒性小、易回收等特点，成为提取多酚化合物最常用的试剂[11]。本试验以桑椹果为试验材料，以乙醇溶液为提取剂，通过单因素试验和正交试验，分别研究乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、提取pH对桑椹总多酚得率的影响，为桑椹资源的开发以及桑椹产品功能特性的评价奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 材料

桑椹：由西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所提供。2009年5月采摘，将刚采摘的成熟鲜桑椹，用清水洗净后在自然阴凉处沥干水分，每2 kg分装在一袋，在袋中放入一包冷冻剂，存入-40℃冰箱中，备用。

1.1.2 主要试剂

Folin试剂：上海喜润化学工业有限公司；没食子酸：科邦生物有限公司；无水碳酸钠、无水乙醇、盐酸：均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

UV-1240紫外分光光度计：日本岛津公司；BFM-GBI贝利粉碎机：济南贝利粉技术工程有限公司；KDC-40低速离心机：科大创新股份中佳分公司；R-200旋转蒸发仪：瑞士步琪公司；HH-S6电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹总多酚的分析方法

用福林酚法测定桑椹多酚类化合物含量。

1.3.1.1 标准曲线的制作

用10mL蒸馏水溶解0.05g没食子酸，定容至500mL，分别移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL到100 mL容量瓶中，各加入50 mL蒸馏水，加入福林酚试剂1 mL后摇匀，静置4 min～5 min，加入15% 的Na2CO3溶液2 mL，用蒸馏水定容，置于25℃的恒温水浴锅中60 min反应。将反应显色后的样品溶液，置于分光光度计波长为760 nm下测定吸光光度值。以吸光度值为纵坐标，以没食子酸浓度为横坐标绘制曲线。所得到的线性方程为y=0.0811x，R2=0.9986，y为吸光度，x为没食子酸浓度（μg/mL）。

1.3.1.2 样品测定

取提取的桑椹样品1 mL加入到100 mL容量瓶中，加入50 mL蒸馏水振荡摇匀，加入Folin酚试剂1 mL摇匀，静置约4 min～5 min，加入15% 的Na2CO3溶液2 mL，混匀后用蒸馏水定容至刻度，置于25℃的恒温水浴中反应60 min，在760 nm波长下测定吸光度，在标准曲线上查出所对应的多酚含量，然后根据公式（1）计算桑椹多酚的得率。

式中：M为桑椹多酚的得率；μg/g，A为吸光度；N为稀释倍数；m为样品质量，g。

1.3.2 桑椹总多酚提取的单因素试验

以桑椹总多酚得率为评价指标，分别对乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、提取pH进行单因素试验，以确定各因素对桑椹总多酚提取效果的影响和适宜的范围。所有处理均进行3次重复试验。

1.3.3 桑椹中总多酚提取的正交试验

在单因素试验的基础上，以提取浓度（A）、提取料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）、提取酸度（E）为影响因素，以桑椹总多酚得率为指标，选用L16（45）正交试验设计表，优化提取工艺参数，做两次重复试验。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of L16（45）orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 桑椹多酚提取单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g，按料液比为1：10（g/mL）比例分别加入pH为5的0%、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液后迅速密封，在60℃恒温水浴中提取1 h。提取结束后用纱布进行粗过滤，然后将粗滤液在3000 r/min下离心10 min，将上清液完全转入100 mL容量瓶，定容后测定，结果见图1。

图1 乙醇浓度对桑椹多酚提取的影响Fig.1 Influences of ethanol concentration on yield of total polyphenols from mulberry

从图1中可以看出，随着乙醇浓度增大，提取的桑椹多酚得率随之增大。在乙醇浓度为60%时，总多酚得率达到最大值，而随着乙醇浓度进一步增大，多酚得率开始下降，下降到一定值后，在乙醇浓度为80%时，趋于平缓，得率变化减小。故选取乙醇浓度为60%作为进一步试验的总多酚提取剂。

2.1.2 料液比对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g，分别取料液比（g/mL）为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以pH为5的60%乙醇溶液为提取溶剂，密封后在60℃的恒温水浴中提取1 h。提取结束后将提取液用纱布粗过滤，再将粗滤液在3000 r/min下离心10 min，将上清液完全倾入100 mL容量瓶，定容后测定，分析结果见图2。

从图2中可以看出，当随着料液比（g/mL）比例增大时，桑椹总多酚得率随之增大。在料液比（g/mL）为1∶15时，桑椹多酚得率达到最大值，而随着料液比（g/mL）比例逐步增大时，得率开始下降，当从料液比（g/mL）为1∶20至1∶30之间时，总多酚得率变化较小。所以选取提取料液（g/mL）比为1∶15时较适宜。

图2 料液比对桑椹总多酚得率的影响Fig.2 Influences of ratio of mulberry to ethanol on yield oftotal polyphenols from mulberry

2.1.3 提取时间对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g，按料液比（g/mL）1∶10比例加入pH为5的60%乙醇，在60℃的恒温水浴分别提取30、60、90、120、150、180、210 min，结束后将提取液用纱布粗过滤，粗滤液在3000 r/min下离心10 min，将上清液完全倾入100 mL容量瓶，定容后测定，结果见图3。

图3 提取时间对桑椹多酚提取的影响Fig.3 Influences of extraction time on yield of total polyphenols from mulberry

从图3中可以看出，当提取时间增大时，总多酚得率没有显著变化。当提取时间达到120 min时，桑椹多酚得率值达到最大。随着提取时间的延长，总多酚得率有所下降。若提取时间过长，不仅杂质溶出较多，同时使得多酚化合物长时间受热分解损失，因此确定提取时间为120 min较为适宜。

2.1.4 提取温度对桑椹多酚提取的影响

取桑椹样品2 g，按料液比（g/mL）1∶10比例加入pH为5的60%乙醇溶液，分别在温度为20、30、40、50、60、70、80℃提取1 h。提取结束后提取液用纱布粗过滤，粗滤液在3000 r/min下离心10 min，将上清液完全倾入100 mL容量瓶，定容后测定，结果见图4。

从图4中可以看出，随着提取温度升高时，总多酚得率迅速上升。在提取温度为60℃时，桑椹总多酚得率达到最大，若提取温度增高，多酚得率又开始迅速下降，这可能与多酚化合物的热不稳定性有关，因此选定提取温度为60℃为宜。

2.1.5 提取pH对桑椹多酚提取的影响

图4 提取温度对桑椹多酚提取的影响Fig.4 Influences of temperature on filed of total polyphenols from mulberry

取桑椹样品2 g，按料液比（g/mL）为1∶10比例加入不同pH的60%乙醇，pH分别为2、3、4、5、6、7，在60 ℃的恒温水浴中提取1 h。提取结束后提取液用纱布粗过滤，粗滤液在3000 r/min下离心10 min，将上清液完全倾入100 mL容量瓶，定容后测定，结果见图5。

图5 提取pH对桑椹多酚提取的影响Fig.5 Influences of pH value on field of total polyphenols from mulberry

从图5中可以看出，当随着提取酸度减小即pH增大时，桑椹总多酚得率随之增大，并且在提取溶剂pH为4时，得率达到最大值。而随着提取溶剂pH增大，提取量值又开始迅速下降。故溶剂的pH为4时提取效果较好。由于在中性及碱性pH下都会破坏多酚化合物的结构，导致其损失。因此，一般在酸性条件下可以保护多酚化合物，从而提高提取得率。

2.2 桑椹多酚提取工艺的优化

在以上单因素试验的基础上，以桑椹总多酚得率为指标，采用五因素四水平正交试验方案对提取工艺参数进行优化，考察乙醇浓度、提取料液比、提取时间、提取温度以及提取溶剂pH桑椹总多酚得率的影响。正交试验设计及结果见表2。方差分析结果见表3。

由极差分析可以看出（表2），5个因素对多酚提取效果影响的主次顺序为：A>C>D>B>E，即提取溶剂浓度>提取时间>提取温度>提取料液比>提取pH。试验所得最佳优化工艺组合为A3B3C3D4E2，即乙醇为65%、料液比1∶15（g/mL）、提取时间120 min、提取温度65 ℃、提取为pH为4。

从表3方差分析可知，乙醇浓度和提取时间对桑椹总多酚得率在α=0.01水平上有极显著的影响，料液比、提取温度和pH在α=0.05水平上对桑椹总多酚得率均有显著的影响。

表2 桑椹总多酚的提取正交试验方案及结果Table 2 Results of the orthogonal experiment of extraction total polyphenol from mulberry

表3 正交设计方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

由于得到的优化组合不在正交试验组合中，对优化组合进行了2次重复验证试验，经分析，桑椹总多酚得率为6709μg/g，说明该工艺可行。

3 结论

在单因素试验基础上，采用正交试验设计对其桑椹总多酚提取工艺进行优化，得到优化的提取工艺参数为：乙醇浓度为65%、料液比为1∶15（g/mL）、提取时间为120 min、提取温度为65℃、提取的pH为4。在此条件下总多酚的提取含量是6709μg/g。

通过极差分析和方差分析，影响桑椹总多酚提取效果的因素主次顺序为提取溶剂浓度>提取时间>提取温度>提取料液比>提取酸度，并且乙醇浓度和提取时间在0.01水平上对桑椹总多酚的提取有极显著的影响，料液比、提取温度和pH在0.05水平上对桑椹总多酚的提取有极显著的影响。

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