转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂存活和繁殖的影响

白树雄， 张洪刚， 葛 星， 王振营

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

自Losey等［1］在《自然》杂志上报道了转基因玉米花粉能对帝王斑蝶造成伤害后，在全球范围内立即掀起了一场有关Bt玉米是否伤及帝王斑蝶的争论，尽管最后证实该研究在试验设计、方法上均存在问题［2］，但由此引发的Bt玉米对非靶标昆虫的影响的争论至今从未停止。

转基因抗虫作物对天敌的影响主要有两条途径，一是天敌昆虫直接取食转基因抗虫植物组织（如花粉、组织汁液等）或转基因抗虫植物上寄主体内的Bt杀虫蛋白所造成的直接毒性；二是转基因抗虫作物对寄主的影响（如营养质量的改变）或寄主挥发性物质发生了变化间接地影响到天敌的寄主搜寻、寄主识别和寄主接受行为以及生长发育等。许多捕食性和寄生性天敌可以取食植物的组织或产物，花粉、花蜜、蜜露和植物汁液都可以成为它们的食物。

亚洲玉米螟［Ostrinia f ur nacalis（Guenée）］属世界性害虫，也是我国玉米第一重要害虫，严重影响玉米的产量和质量。腰带长体茧蜂（Macrocentr us cingul u m Brischke）是亚洲玉米螟幼虫的主要寄生性天敌，其自然寄生率可高达30%左右，对玉米螟种群起着重要的调控作用［3－4］。研究表明，饲喂玉米花粉液能显著延长腰带长体茧蜂的成虫寿命［5］。

转Bt基因作物的大面积种植，靶标害虫或非靶标害虫取食转基因抗虫植物组织后，杀虫蛋白能否通过食物链向寄生性天敌传递？是否会对天敌昆虫造成不良影响？同时，一些天敌昆虫还可能直接取食转基因作物的组织，直接摄取杀虫蛋白，是否会对天敌昆虫造成不良影响？本文主要研究腰带长体茧蜂取食转cr y1F基因玉米花粉后对其寄生率、寿命、繁殖力产生的影响，为进一步明确转基因抗虫玉米对非靶标生物的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

腰带长体茧蜂采自河北省保定市，在温度26℃，相对湿度80%，光周期16L∥8D的条件下，置于养蜂笼（50 c m×40 c m×60 c m）中，饲以20%蜜糖水。

亚洲玉米螟幼虫采用周大荣等标准养虫技术和无琼脂半人工饲料的饲养方法进行饲养［6－7］。选用亚洲玉米螟4龄幼虫供试。

1．2 供试玉米花粉

供试转Bt基因玉米及其对照花粉均采自河北廊坊中国农业科学院试验基地。玉米品种为转cry1F基因玉米及其对照品种。经检测，转基因玉米花粉中Cr y1F蛋白含量为1 060 ng／g。

1．3 转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂寿命的影响

在养蜂笼中分别放入水＋Bt玉米花粉、水＋对照玉米花粉、20%的蜂蜜水＋Bt玉米花粉、20%的蜂蜜水＋对照玉米花粉、20%的蜂蜜水和水的不同处理供成蜂取食，然后每笼引入腰带长体茧蜂雌雄蜂各30头。每日调查腰带长体茧蜂的死亡状况，直至所有茧蜂全部死亡为止。对各处理间腰带长体茧蜂寿命进行分析。

1．4 转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂寄生及繁殖力的影响

将截为1 c m长的新鲜普通玉米秆若干放于直径为20 cm培养皿中，然后接入50头亚洲玉米螟4龄幼虫，放入养蜂笼中，待其取食1 h后再引入腰带长体茧蜂雌雄各10头，寄生24 h。期间，养蜂笼中分别放入转cr y1F基因玉米及对照玉米花粉、蜜水、水的不同处理供成蜂来取食。每日调查并更换亚洲玉米螟幼虫供其寄生，试验持续72 h。寄生后将玉米螟幼虫接入琼脂饲料中继续饲养直到5龄末，挑出化蛹未寄生的玉米螟，计算寄生率、茧块重量、每茧块茧数及羽化率。

1．5 对取食转cry1F基因玉米花粉后的腰带长体茧蜂体内Cry1F杀虫蛋白的ELISA检测

1．5．1 检测方法

收集取食过不同处理转基因玉米及对照玉米花粉的腰带长体茧蜂单个个体称量后放入灭菌研钵中，加入少许液氮研磨成粉状，然后放入2 mL离心管中，加入Cry1F提取缓冲液1×PBST，4℃静止30 min；低温下（2～3℃）超声波粉碎1 min，12 000 r／min离心10 min，取上清液，待测。Bt蛋白的定量测定按照试剂盒说明书方法进行。

1．5．2 检测仪器及试剂盒

酶标仪（Multiskan Ascent，芬兰 Ther mo公司）、台式冷冻离心机（5804 R，德国Sig ma公司）、电子天平、移液器等；Bt－Cry1F ELISA 试剂盒（美国Agdia公司）。

1．6 数据统计

对不同处理的寄生率、茧块重量、羽化率、寿命进行方差分析（ANOVA LSD检验）（SAS Instit ute Inc．，1989）。

2 结果与分析

2．1 转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂寿命的影响

对腰带长体茧蜂寿命的试验表明，取食水＋Bt玉米花粉的腰带长体茧蜂的寿命与对照没有显著差异；取食蜂蜜水＋Bt玉米花粉的腰带长体茧蜂雄蜂的寿命与对照相比差异达到显著，但雌蜂的寿命与对照无显著差异；差异还来自于蜂蜜水和水之间，取食含有蜂蜜水的玉米花粉，无论转Bt基因花粉或对照花粉其寿命都显著高于水＋玉米花粉处理（雌蜂：d f＝5，12，F＝23．48，p＜0．000 1；雄蜂：d f＝5，12，F＝54．80，p＜0．000 1）（表1）。

表1 不同食物对腰带长体茧蜂寿命的影响

2．2 转cr y1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂寄生及繁殖力的影响

转cr y1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂的影响试验表明，寄生时间为3 d内各处理间腰带长体茧蜂的寄生率（d f＝5，12；F＝0．88，p＝0．526 0）、茧块重量（df＝5，12，F＝0．71，p＝0．618 0）、每茧块茧数（df＝5，12，F＝0．60，p＝0．697 8）以及羽化率（df＝5，12，F＝1．46，p＝0．205 3）都没有显著差异（表2），说明取食含有转cr y1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂的寄生、生长发育和繁殖没有显著影响。

表2 不同食物对腰带长体茧蜂寄生及繁殖力的影响

2．3 取食转基因玉米花粉后的腰带长体茧蜂ELISA检测

饲喂前ELISA检测表明，转cr y1F基因玉米花粉中Cry1F蛋白含量为1 060 ng／g。

对取食转cr y1F基因玉米花粉的腰带长体茧蜂进行ELISA检测，结果表明，腰带长体茧蜂取食含有转cr y1F基因玉米花粉的食物1～7 d，在其体内未检测到转基因成分（图1）。

图1 取食转基因玉米花粉的腰带长体茧蜂ELISA分析

3 结论与讨论

随着转基因抗虫作物种植范围和面积的不断扩大，转基因抗虫作物对天敌昆虫和其他非靶标昆虫的潜在影响受到关注［8－9］，特别是这些转基因抗虫作物已经成为害虫综合治理的重要措施［10］。

捕食性和寄生性天敌昆虫在捕食或寄生以转基因抗虫作物为食物的害虫后，其存活、生长发育以及捕食或寄生能力的变化不尽相同，研究大多认为杀虫蛋白对天敌生长发育和种群动态无显著影响［11］。用混有商业Bt制剂的蜂蜜琼脂饲喂卷叶蛾赤眼蜂（Trichogramma cacoeciae），对雌蜂寄生能力没有不利影响［12］。T．pr atissolii和短管赤眼蜂（T．pretiosum）在取食含有6种不同Bt制剂的蜂蜜溶液后，其寿命和繁殖力没有受到不利影响［13］。拟澳洲赤眼蜂（T．confusum）雌蜂取食转cry1Ac＋Cp TI基因棉花粉与对照相比，其寿命和寄生卵数无显著影响［14］。Wang等［15］、吴研等［16］研究表明，转cr y1Ab基因抗虫玉米花粉对玉米螟赤眼蜂（T．ostriniae）的寿命、繁殖以及子代性比没有不利影响。将转cry1Ab基因的玉米花粉、纯化的Cr y1 Ab蛋白分别拌入糖浆饲喂蜜蜂成虫，结果表明取食花粉、Cr y1 Ab蛋白的蜜蜂存活率均无明显差异［17］。表达Cr y1 Ab蛋白的Bt玉米花粉对意大利蜜蜂（Apis mellif era ligustica）的生长发育没有不利影响［18－19］。利用表达 Cry1 Ac杀虫蛋白的Bt棉花粉和Cry1 Ab杀虫蛋白的Bt玉米花粉处理桑叶饲喂不同 龄 期 的 家 蚕 （Bombyx nori）［20］和 利 用 转cry1Ac和cry1A＋CpTI的棉花花粉处理柞树叶饲喂柞蚕 （Antheraea pernyi）幼虫后［21］，家蚕和柞蚕各龄期的死亡率、蛹重、茧重、化蛹率、羽化率和产卵量与对照没有显著差异。

本文研究结果表明，在腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟幼虫时补充转cr y1F基因玉米花粉作为食物对其寄生率、茧块重量、每茧块茧数、羽化率与对照玉米花粉无显著差异；在蜂蜜水＋Bt基因玉米花粉处理中虽然与对照玉米花粉处理相比在雄蜂的寿命上有一定差异，但在雌蜂的寿命上并没有显著差异。虽然Bt玉米花粉中检测到Cry1F杀虫蛋白，但在取食Bt花粉的腰带长体茧蜂中没有检测到Cry1F杀虫蛋白。综上，转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂没有不利影响，表达Cry1F杀虫蛋白的Bt玉米作为害虫综合治理的重要措施与寄生性天敌腰带长体茧蜂协同作用，可以有效减少抗性玉米螟的存活，延缓害虫抗性的产生。

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