Bt抗性和敏感棉铃虫钙黏蛋白及氨肽酶N1表达量的比较

张 涛， 魏纪珍， 张丽丽， 陆 琼， 梁革梅＊， 杨 朗

（1．广西大学农学院，南宁 530004； 2．中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193； 3．广西农业科学院植物保护研究所，南宁 530007）

Bt毒蛋白与昆虫中肠上皮细胞的刷状缘膜囊泡（br ush bor der membrane vesicles，BBMV）上的一个或多个受体结合是其发挥毒性的关键［1］。已经报道的受体蛋白主要有钙黏蛋白（cadherin，CAD）、氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、糖脂类碳水化合物、肌动蛋白、碱性磷酸酯酶和V－ATP酶亚基A等，昆虫对Bt产生抗性与其中肠的受体蛋白直接相关，受体蛋白的突变、表达量、结合能力的改变等是昆虫对Bt毒素产生抗性的主要原因［2］。

APN是第一个被发现的、在Bt毒素杀虫机制中起作用的毒素受体蛋白。2002年Gill等采用显微注射法获得了含烟草天蛾（Manduca sexta）APN基因的转基因黑尾果蝇（Drosophila mel anogaster）品系，APN在非敏感宿主果蝇中肠和中胚层获得了表达，这种转基因品系果蝇对Cry1 Ac毒素变得很敏感，该研究首次从虫体水平证实APN可作为Cry1Ac毒蛋白的功能性受体［3］。Rajagopal等利用RNA干扰技术（RNAi）抑制斜纹夜蛾（Spodoptera litura）幼虫中肠APN的表达，发现可降低斜纹夜蛾对Bt的敏感性，证明APN是Bt毒素的受体，并与毒素蛋白发挥毒力有关［4］。

Vadla mudi等［5］首次报道了钙黏蛋白是烟草天蛾中肠上皮组织中一种Cry1A的受体（BT－R1），能特异性地与Cry1 Ab结合。Nagamatsu等［6］将家蚕钙黏蛋白BtR175在Sf9细胞系中进行表达，发现Bt R175的表达导致了膜对Cry1Aa渗透量的改变，进一步证实了类钙黏蛋白是Cry1Aa的一种受体。随后的研究还表明，钙黏蛋白不仅是毒素在鳞翅目昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体，还参与了启动胞内信号转导途径［2，7－9］。

随着转Bt基因棉花在我国的大面积商业化种植，棉铃虫（Helicover paar migera）的危害得到了很好的控制［10］。但由于转入的Bt基因在作物体内持续表达，使得害虫在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的高压选择，因而棉铃虫对Bt的抗性问题是影响未来转基因棉花发展的关键因素。关于棉铃虫APN和CAD基因克隆、表达、及突变、缺失等变化与抗性的关系已经进行了一些研究，本文主要是利用实时荧光定量PCR技术，比较Bt抗性和敏感棉铃虫中肠两种主要受体蛋白—钙黏蛋白和氨肽酶N的表达量变化，分析受体蛋白表达量变化与抗性的关系，进一步明确棉铃虫对Bt的抗性机制，为抗性治理策略的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 棉铃虫品系

敏感品系（96S）：1996年采自河南省新乡棉田、在室内用人工饲料饲养至今，期间未接触任何杀虫剂。

抗性品系（Bt R）：用Cry1Ac毒蛋白在室内筛选了175代，相对抗性倍数为3 536．5倍。筛选方法见梁革梅等［11］。

棉铃虫在温度（27±2）℃，相对湿度（75±10）%，光周期L∥D＝14 h∥10 h的条件下饲养。幼虫在指形管中用人工饲料饲养，人工饲料配方参照梁革梅等［12］方法，成虫在产卵笼中用10%糖水补充营养。

1．2 试剂和仪器设备

主要试剂：RNA分离试剂（Trizol）、DNA酶试剂盒和c DNA合成试剂盒购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR及常规PCR试剂购自大连宝生物公司（Ta Ka Ra）。其他试剂均为国产分析纯。

主要仪器：7500 Fast实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）公司；凝胶成像系统，美国伯乐公司（BIO－RAD Corporation）；5417R 冷冻离心机，德国艾本德（Eppendorf Cor poration）公司。

1．3 试验方法

1．3．1 棉铃虫总RNA的提取

由于1、2、3龄棉铃虫的虫体较小，取整头幼虫备用；解剖4、5龄棉铃虫幼虫，截取中肠，用生理盐水（0．7%）冲洗干净后，用吸水纸将液体吸干。所有样品立即放入液氮中，之后置－80℃冰箱保存备用。采用多头提取方法，每个龄期棉铃虫所用幼虫头数分别为：1龄80头，2龄40头，3龄15头，4龄15头，5龄10头。试验重复3次。

用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取棉铃虫总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用分光光度计检测其纯度并定量，－80℃保存。

1．3．2 cDNA的合成

先用DNaseⅠ去除RNA中的基因组DNA，再根据Invitrogen公司的Super ScriptⅢFirst－Strand试剂盒操作说明合成c DNA。

1．3．3 常规PCR模板检测

取经过消化后的RNA和反转录得到的c DNA分别用Actin引物进行常规PCR，以证明RNA中无基因组DNA污染和反转录得到的c DNA符合试验要求。

Actin－F：5′－CATCTACGAGGGTTACGC－3′，Tm 50．8℃；

Actin－R：5′－CATCTGTTGGAAGGTGGA－3′，Tm 50．8℃。

扩增长度574 bp，由Invitr ogen公司合成。

PCR反应：模板1μL，加入10×Ex Taq缓冲液5μL（含 Mg2＋），正向和反向引物各1μL（10μmol／L），d NTP 4μL（2．5 mmol／L），Ex Taq DNA 聚合酶0．25μL（5 U／μL），加水至50μL，混匀。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃保温10 min。1%琼脂糖凝胶电泳查看结果。

1．3．4 实时荧光定量 PCR（real－ti me quantitative PCR，Rq－PCR）

引物及探针合成：参考Gen Bank登录号分别为AF519180、AF441377和X97615的CAD、APN1和actin基因全长设计引物。以actin为内参基因。采用Taq Man技术进行荧光定量PCR。探针5′端为FA M标记，探针3′端为Eclipse标记。q RT－PCR上游引 物 （f or war d pri mer－F）、下 游 引 物 （reverse pri mer－R）、探针（probe－P）设计序列见表1。所需引物及探针由大连宝生物公司合成。

表1 实时荧光定量PCR引物及探针序列

Rq PCR反应体系：在冰上配制25μL反应体系，包括Premix Ex Taq 12．5μL，灭菌蒸馏水（dd H2O）8．7μL，正向和反向引物各1μL（10μmol／L），ROX Reference DyeⅡ（50×）0．4μL，荧光探针溶液0．4μL，c DNA 1μL，振荡器混匀。每个样品设3个重复，每个探针设3个空白对照。试验重复3次。

RqPCR反应程序：95℃预变性1 min；95℃5 s，60℃25 s，40个循环；60℃25 s期间收集荧光信号。

RqPCR引物扩增效率检验：以96S的c DNA为模板，初始浓度定为1，加水稀释5、10、50、100、500、1 000倍，得到浓度分别为0．2、0．1、0．02、0．01、0．002、0．001，加上初始浓度，共7个不同浓度的c DNA模板。以此c DNA模板，按照上述实时荧光定量PCR反应体系和程序配制反应液，每个模板设4个重复，每个基因设4个空白对照。

1．4 数据分析

表达量的计算参考Livak和Schmittgen［13］的方法，即2－△△CT法：首先，对所有测试样本和校正样本，用目的基因的CT值减去内参基因的CT值，△CT＝目的基因CT－内参基因CT。然后，用校正样本的△CT值归一试验样本的△CT值，△△CT＝样本的△CT－参照的△CT。最后，计算基因表达量比率，2－△△CT＝样本表达量比值。分别以96S品系1龄幼虫的CAD和APN1的表达量为1进行比较。同一龄期抗、感棉铃虫表达量的差异比较采用t测验；同一品系、不同龄期间的比较采用两因素方差分析，用LSD法进行多重比较。用DPS软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2．1 探针可靠性验证

根据反应导出的数据，以△CT（目的基因CAD＼APN1的CT值减去内参基因actin的CT值）为Y轴，以不同稀释浓度的c DNA模板的－lg值为X轴作图，“C”为c DNA的相对浓度，进行探针可靠性验证。结果表明：CAD（－0．002 8）和APN1（0．020 5）的方程

斜率的绝对值都小于0．1，符合试验要求，证明试验所 设计的探针符合荧光定量PCR试验要求（图1）。

图1 CAD、APN1与β－actin探针可靠性验证

2．2 不同龄期抗、感棉铃虫CAD表达量的比较

图2显示了抗、感棉铃虫CAD的相对表达量，结果表明：与敏感品系相比，抗性品系的1龄、2龄棉铃虫CAD表达量明显降低（p值分别为0．002、0．007 3），差异达到极显著水平；但抗、感品系3龄、5龄幼虫CAD的表达量差异不显著（p值分别为0．92、0．53）；抗性品系4龄幼虫的CAD表达量反而略高于敏感品系，差异达到显著水平（p＝0．022）。但整体比较抗、感品系棉铃虫幼虫的CAD表达量，抗性品系幼虫的CAD表达量显著降低，差异极显著（p＜0．001）。

图2 抗、感品系棉铃虫的CAD相对表达量

不同龄期的棉铃虫幼虫CAD表达量差异也极显著（表2）。在敏感品系96S中，1龄幼虫CAD的表达量最高，其次是2龄、5龄幼虫，3龄、4龄幼虫的表达量最低；而在抗性品系中各龄期幼虫CAD表达量由高到低的顺序为：1龄＞5龄＞4龄＞3龄＞2龄，其中4龄、3龄、2龄间差异不显著。

表2 不同龄期棉铃虫幼虫CAD表达量的比较1）

2．3 不同龄期抗、感棉铃虫APN1表达量的比较

抗、感棉铃虫APN1的相对表达量如图3所示，结果表明：与敏感品系相比，抗性品系的2龄棉铃虫APN1表达量明显降低（p＝0．003 6），差异达到极显著水平；但抗、感品系1龄、3龄、5龄幼虫APN1的表达量差异不显著（p值分别为0．057、0．996 8、0．647 9）；抗性品系4龄幼虫的 APN1表达量反而略高于敏感品系，差异达到显著水平（p＝0．012）。但比较抗、感品系1龄～5龄棉铃虫幼虫整体APN1的表达量，抗性品系幼虫的APN1表达量显著低于敏感品系，差异达到极显著（p＜0．001）。

图3 抗、感品系棉铃虫的APN1相对表达量

不同龄期的棉铃虫幼虫APN1表达量差异也极显著（表3）。在敏感品系96S中，1龄、2龄幼虫APN1的表达量明显高于其他龄期幼虫，其次是5龄幼虫，3、4龄幼虫的表达量最低；而在抗性品系中各龄期幼虫APN1表达量由高到低的顺序为：1龄＞5龄＞4龄＞2龄＞3龄，各龄期间差异都达到极显著。

表3 不同龄期棉铃虫幼虫APN1表达量的比较1）

3 讨论

CAD的表达量及其分布在不同昆虫、不同时期是不同的，而且由于抗性的产生可能会造成表达量的不稳定。如Midboe等发现，BT－R（钙黏蛋白）只在烟草天蛾幼虫期表达，在卵和成虫期不表达，幼虫的不同发育时期表达量也不同，表达量随着幼虫虫龄增长而增加［18］；王桂荣等运用RT－PCR技术，分析了钙黏蛋白基因在棉铃虫敏感品系不同组织中的表达情况，发现钙黏蛋白主要在棉铃虫中肠表达，在前、后肠表达量很低，在肠道以外的组织中不表达［19］；Carriére等利用实时荧光定量PCR技术分析棉红铃虫［Pectinophor a gossy piell a （Saunders）］的钙黏蛋白基因表达量，发现钙黏蛋白在幼虫期表达量最高，在成虫和胚胎中也都表达，在敏感棉红铃虫所有时期的表达都比较稳定，但抗性品系Bt R 1龄～3龄幼虫的表达量最高，其次是4龄幼虫和成虫，在蛹和胚胎中表达量最低，且4龄幼虫前肠和中肠表达量最高［20］。作者的试验结果显示，不仅抗性棉铃虫的CAD表达量不稳定，而且敏感品系棉铃虫的CAD表达量也不稳定，1龄幼虫的表达量最高，其次是2龄、5龄幼虫，3龄、4龄表达量最低，抗性品系还表现为表达量提前降低。这进一步说明了不同龄期幼虫CAD表达量的变化趋势在不同昆虫间差异较大。

APNs在不同昆虫、不同时期体内的分布及其表达量也是不同的，如苹浅褐卷蛾（Epip hyas postvittana）已被分离的5个APN基因在整个幼虫期都表达，表达量随龄期的增大而增加，且中肠中的表达量最高［14］；Angelucci等测量了棉铃虫中肠APN的表达量，发现APN1－APN4也在棉铃虫的整个幼虫期都表达［15］；Crava等测定了欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）幼虫期 APN的mRNA表达量，发现APN在幼虫各个龄期都表达，5龄幼虫中APNs主要在中肠表达［16］。本研究通过实时荧光定量PCR的方法，比较了不同龄期棉铃虫幼虫的APN1表达量，也发现APN1在敏感品系1龄～5龄幼虫期都表达，但表达量随龄期的增加呈现“V”字形变化，1龄、2龄幼虫的表达量最高，3龄、4龄时显著降低，到5龄时表达量又有所增加。造成这种结果的原因还需要进一步分析。

虽然抗性品系不同龄期棉铃虫的APN1表达量变化趋势与敏感品系相近，但表现为表达量提前降低，与1龄幼虫相比，2龄幼虫的表达量显著降低，2龄、3龄幼虫的表达量最低，4龄、5龄又逐渐升高。Chougule等曾报道，取食不同饲料会造成棉铃虫APNs表达量的差异［17］，所以我们分析抗性品系棉铃虫一直取食含Bt毒蛋白的饲料，可能是造成APN1表达量提前降低的主要原因。

钙黏蛋白和APNs的表达量与抗性存在明显相关性，已先后通过PCR、Norther n blot、RNAi等技术在不同昆虫中得到了证实。如王桂荣等利用RTPCR技术比较了抗、感棉铃虫CAD的表达，发现棉铃虫对Cr y1 Ac产生抗性后，钙黏蛋白的表达量明显降低［19］；Carriére等利用实时荧光定量 PCR 技术，发现了棉红铃虫抗性品系钙黏蛋白表达量不稳定的现象［20］；Herrero等通过Nort her n blot比较了甜菜夜蛾（Spodopter a exigua）的APNs表达量，发现APN1在抗性昆虫中不表达，说明APN1的不表达与甜菜夜蛾对Cry1Ca的抗性相关［21］；Rajagopal等构建了斜纹夜蛾的ds RNA，并将其注入5龄幼虫的血淋巴中，干扰了APN基因的RNA转录，48 h后处理组幼虫APN的表达比对照组减少了80%，而LC50提高了70%，证明APN的表达量与幼虫的敏感性是显著相关的［4］；Yang等［22］发现 Cry1 Ab抗性小蔗螟品系中，APN1、APN2和APN3的表达量相对于敏感品系都有不同程度的下降；利用RNAi技术降低敏感昆虫体内3种APN的表达量后，敏感性伴随着APN表达量的下降而出现了下降。

作者的结果也发现抗性品系棉铃虫的CAD和APN1表达量都明显降低，尤其是1、2龄幼虫时表现明显，抗、感品系差异极显著。这也再次证明了昆虫中肠的钙黏蛋白、APN表达量的下降与抗性相关。但在试验中发现，抗性品系4龄棉铃虫幼虫的APN1和CAD表达量反而比敏感品系高，这可能与抗性品系幼虫一直取食含Bt的饲料有关。本研究在试验中采用了实时荧光定量PCR的方法测定APN1和CAD的表达量，比以前采用其他方法测定的结果具有更好的即时性、良好的重复性、特异性及准确性。这些结果将为我们进一步了解APN和CAD的功能及与抗性的关系奠定基础。

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