L-苯甘氨酸衍生物的合成及其抗糖尿病活性*

李华冲，晏菊芳, 苏小燕, 孔令强, 杨大成

(1． 西南大学 化学化工学院，重庆 400715； 2． 成都地奥制药集团 药物筛选中心，四川 成都 610041)

选用价廉易得的天然原料,采用相对简单的合成方法制备结构新颖的抗糖尿病药物,是化学与药学工作者的艰巨任务。

苯甘氨酸衍生物用途广泛,如D-对羟基苯甘氨酸是β-内酰胺类半合成抗生素的侧链,用于生产如阿莫西林、头孢羟氨苄等抗生素药物[1]；氯代苯甘氨酸衍生物不仅用于抗菌类药物、抗血栓类药物以及农药等的制备,而且还用于青霉素类衍生物、头孢菌素类衍生物的合成[2]等。但到目前为止,苯甘氨酸及其衍生物作为抗糖尿病药物的研究还未见文献报道。

本文借鉴具有强的PPARγ激动活性的L-酪氨酸衍生物的结构特征[3],设计了L-间氨基苯甘氨酸作为关键中间体,通过对其结构的进一步修饰制得具有多种结构特点的L-间氨基苯甘氨酸衍生物,经过抗糖尿病活性筛选,期望得到具有抗糖尿病活性的先导化合物。

本文以L-苯甘氨酸为原料,通过苯环硝化[4～6]、α-氨基保护[4,5,7～9]、羧基保护[10]及硝基还原[11～14]等反应,合成了中间体L-间硝基苯甘氨酸衍生物(1，2a～2c和5c),产物L-间氨基苯甘氨酸(4)和L-间氨基苯甘氨酸衍生物(3a～3c,6c)(Scheme 1)，其中2b,5c, 3b,3c及6c为新化合物，其结构经1H NMR，13C NMR及MS表征。初步测试了部分化合物的抗糖尿病活性。

CompabcRBocFmocCbz

Scheme1

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

X-6型精密显微熔点仪；WZZ-2S型自动旋光仪；AV-300型超导核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；GX型FT-IR红外光谱仪(KBr压片)；Agilent 1946B MS(ESI MS)型质谱仪。

1[6]按文献方法合成；L-苯甘氨酸(L-Phg)，苄基琥珀酰亚胺基碳酸酯(Z-OSu)，二叔丁氧基碳酸酐(Boc2O)和9-芴甲基丁二酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)，分析纯，成都凯泰新技术有限责任公司；其余所用试剂均为市售分析纯。

1．2 合成

(1) 2的合成通法[8，9]

在反应瓶中加入1 2 mmol, 10%Na2CO3溶液或10%K2CO3溶液5 mL,冰浴冷却下搅拌使其溶解；缓慢滴加Fmoc-OSu 1.96 mmol(或Z-OSu 2.2 mmol,或Boc2O 2.4 mmol)的丙酮(3.5 mL)溶液,滴毕,于20 ℃～30 ℃反应至终点(TLC跟踪,pH 9～10)。加适量水稀释，分液，水层用乙醚(3×5 mL)萃取。冰浴冷却下，水相用2 mol·L-1HCl调至pH 3～4,减压蒸除丙酮，残余物用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并萃取液，用饱和NaCl溶液洗至中性，无水MgSO4干燥，减压蒸除乙酸乙酯得2a～2c。

2a： 淡黄色固体，收率83.2%，m.p.143 ℃～150 ℃，[α]+72°(c1.0, CH3OH)。

2b： 类白色固体，收率87.4%，m.p.101.4 ℃～105.6 ℃，[α]+43.8°(c2.4, DMF);1H NMRδ: 4.24～4.32(m, 1H, CH), 4.35(s, 2H, CH2), 5.45(d,J=7.95 Hz, 1H, CH), 7.28～7.35(m, 2H, ArH), 7.39～7.44(m, 2H, ArH), 7.68(d,J=7.65 Hz, 1H, ArH), 7.75(d,J=7.20 Hz, 2H, ArH), 7.88～7.90(m, 3H, ArH, CONH), 8.20(d,J=7.83 Hz, 1H, ArH), 8.36(s, 1H, ArH), 8.47(d,J=8.04 Hz, 1H, ArH), 13.24(s, 1H, CO2H);13C NMRδ: 46.6, 57.2, 66.0, 120.1, 122.4, 122.9, 125.3, 127.1, 127.7, 130.0, 134.8, 139.8, 140.8, 143.7, 143.8, 147.8, 155.9, 171.2; ESI-MSm/z: 441.2{[M+Na]+}。

2c： 黄色固体，收率97.9%，m.p.72.5 ℃～74.3 ℃，[α]+122.0°(c2.0, CHCl3)； ESI-MSm/z: 331.2{[M+H]+}。

(2) 5c的合成[10]

在反应瓶中加入2c5 mmol和乙酸乙酯10 mL,搅拌使其溶解；滴加三乙胺0.7 mL和苄溴5 mmol,滴毕，于75 ℃回流反应至终点(TLC跟踪)。过滤，滤饼用乙酸乙酯(3×5 mL)洗涤，合并滤液与洗液，依次用5%NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液各洗两次，用无水MgSO4干燥，减压蒸除溶剂，残余物用混合溶剂[V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶3]重结晶得白色固体5c，收率86.2%，m.p.120.1 ℃～123.6 ℃;1H NMRδ： 5.03(s, 2H, CH2), 5.06(s, 2H, CH2), 5.51(d,J=6.0 Hz, 1H, CH), 6.08(d,J=3.0 Hz, 1H, CONH), 7.18～7.71(m, 12H, ArH), 8.19～8.22(m, 2H, ArH);13C NMRδ: 57.2, 65.9, 66.7, 122.7, 123.1, 127.7, 127.8, 127.9, 128.1, 128.4, 130.1, 134.9, 135.6, 136.7, 139.6, 147.7, 155.9, 169.8; ESI-MSm/z: 421.0{[M+H]+}, 443.0{[M+Na]+}。

(3) 3，4和6c的合成通法

方法一(Zn/NH4Cl/HOAc还原法)： 在圆底烧瓶中加入Zn粉8.9 mmol，NH4Cl 0.2 mmol，2 1.0 mmol及80%乙醇20 mL,搅拌下于65 ℃反应0.5 h～1.0 h；加冰乙酸4.0 mmol，于65 ℃反应至终点(TLC监测)。过滤，滤饼依次用饱和Na2CO3溶液(1×5 mL)，饱和NaCl溶液(3×5 mL)洗涤。后处理方法：①滤液用氨水调至pH 5～6,有大量淡黄色沉淀析出,抽滤,滤饼干燥得黄色固体4； ②滤液用饱和Na2CO3溶液调至pH 9～10后用乙醚(3×10 mL)萃取,水层加入乙酸乙酯20mL,在冰浴下用2 mol·L-1HCl调至pH 3～4,用乙酸乙酯萃取(3×10 mL),合并有机层,用饱和NaCl溶液(3×5 mL)洗涤,无水MgSO4干燥,减压蒸除乙酸乙酯得3和6。

方法二(Zn/CaCl2还原法)： 参照文献[12]方法合成3，4和6c。

3a： 淡黄色固体，收率82.5%，m.p.109 ℃～120 ℃，[α]+86°(c1.0, CH3OH)； ESI-MSm/z: 319.2{[M+Na]+}。

3b： 淡黄色固体，收率85.5%，m.p.124.3 ℃～130.8 ℃，[α]+89.5°(c2.0, DMF)；1H NMRδ: 4.23～4.29(m, 3H, CH, CH2), 4.90～4.95(m, 1H, CH), 6.50～7.90(m, 12H, ArH), 8.09(s, 1H, CONH);13C NMRδ: 46.6, 58.4, 66.0, 113.3, 113.6, 115.1, 120.1, 123.6, 125.6, 127.1, 127.7, 128.7, 129.0, 137.5, 140.7, 143.8, 143.9, 143.8, 148.6, 148.8, 155.9, 172.3, 172.9; IRν: 3 446(CONH), 3 307(NH2), 1 687(C=O), 1 604，1 496(C=C) cm-1； ESI-MSm/z: 389.2{[M+H]+}，411.1{[M+Na]+}。

3c： 淡黄色固体，收率85.8%，m.p.74.3 ℃～80.6 ℃，[α]+81.36°(c2.2, DMF);1H NMRδ: 4.68(s, 1H, CH), 4.90(s, 2H, NH2), 5.03(s, 2H, CH2), 6.38(d,J=7.50 Hz, 2H, ArH), 6.43～7.34(m, 7H, ArH);13C NMRδ: 57.9, 65.5 113.6, 115.0, 121.5, 127.7, 127.8, 128.4, 129.0, 137.0, 137.5, 151.9, 155.9, 172.2; ESI-MSm/z: 301.1{[M+H]+}, 323.1{[M+Na]+}。

4： 淡黄色固体，收率85.4%，m.p.194.5 ℃～203.4 ℃，[α]+31.8°(c1.1, 2 mol·L-1HCl)。

6c： 白色固体，收率81.8%，m.p.59.8 ℃～64.5 ℃;1H NMRδ: 5.06(s, 2H, CH2), 5.09(s, 2H, CH2), 5.12～5.14(m, 1H, CH), 5.16(s, 2H, NH2), 6.51(d,J=7.60 Hz, 2H, ArH), 6.58(s, 1H, ArH), 6.95～7.00(m, 1H, ArH), 7.26～7.35(m, 10H, ArH), 8.20(d,J=7.50 Hz, 1H, CONH);13C NMRδ: 58.5, 65.7, 66.1, 113.3, 113.8, 115.0, 127.6, 127.8, 127.9, 128.0, 128.4, 129.1, 135.9, 136.5, 137.0, 149.0, 156.0, 170.9; ESI-MSm/z: 391.1{[M+H]+}, 413.0{[M+Na]+}。

1．3 PPAR反应元件(PPRE)激动活性检测

将HepG2肝癌细胞常规培养于37 ℃，5%CO2，含100 U·mL-1链霉素和青霉素的低糖DMEM中，在1.5×104个/孔接种于96孔板后培养过夜,参照转染试剂说明书进行质粒转染。转染的质粒包括带有PPRE和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒pPPRE-Luc,及用作转染内参照的带有海肾荧光素酶的质粒phRL-TK,转染24 h后换用含待测样品的培养基,同时设立空白对照(未转染的细胞)、阴性对照(转染的细胞不加样品)和阳性对照[转染的细胞加入匹格列酮(Pioglitazone)]，继续培养24 h后用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)检测荧光素酶活性,根据检测到的化学发光强度L值计算激动率PPRE{PPRE=[(L1样品-L1空白)/(L1阴性-L1空白)]/[(L2样品-L2空白)/(L2阴性-L2空白)]×100%，其中：L1为萤火虫荧光素酶的化学发光强度,L2为内参照海肾荧光素酶的化学发光强度；样品检测浓度为10 μg·mL-1,检测时设双复孔,重复两次}，数据见表5。

2 结果与讨论

以L-苯甘氨酸为原料,先硝化得中间体1，对其α-氨基进行保护(Boc，Fmoc和Z)得2a～2c； 对2c的羧基进一步苄基化得5；2a～2c的硝基还原得3a～3c。

2．1 合成工艺研究

(1)2a～2c： 以Boc2O为酰化剂，10%K2CO3为碱，在1 2.0 mmol,n(1)∶n(Boc2O)=1．0 ∶1.2条件下于30 ℃反应27.9 h，2a的收率达82．5%；放大实验20倍，最高收率达96．1%。

以Fmoc-OSu为酰化剂,10%K2CO3为碱,在THF/H2O为溶剂，pH=9～10, 1 5.0 mmol,n(1)∶n(Fmoc-OSu)=1．00∶0.98的条件下于20 ℃反应0.7 h,2b收率达88.0%。 放大实验5倍或10倍,收率分别为88．4%和88．8%，且产物色泽很好。

以Z-OSu为酰化剂,10%K2CO3为碱，1 5.0 mmol,n(1)∶n(Z-OSu)=1．0∶1.1，在丙酮/H2O中于30 ℃反应约40 h,收率达97.9%。放大反应10倍，收率不变。

(2) 4： 以Zn/NH4Cl/AcOH为还原剂，TLC跟踪显示还原很完全。但采用萃取法进行后处理,收率只有10%左右。TLC分析发现,4主要留在水相。考虑4易于形成内盐或分子间盐,作者采用调节滤液pH的方法,发现有大量淡黄色沉淀析出,由此简易地实现了产物的分离纯化，结果见表1。

(3)3a： 考虑到Boc基团的稳定性,实验采用水合肼还原[13]2a制备3a,收率低于30%。后选择了弱酸性的Zn/NH4Cl/AcOH还原体系,但还原产物复杂,存在Boc基团脱落的情况；进一步弱化体系的酸性,尝试了中性的Zn/CaCl2还原法,发现还原的最低收率也达到79.4%(表2)。 由表2可见，Zn/CaCl2还原2a制备3a具有反应条件温和、操作简单等优点,具有较好工业价值。

(4)3b： 参照文献[10]的方法将2b和试剂分次加入,发现Zn粉和原料会附着在反应瓶上,反应不均匀,收率最高只有33.3%。对文献[10]方法进行改进,采用所有反应物一次性加入的方式,但收率仍然很低(<23.3%),推测是AcOH使反应物黏在一起导致反应效果不好。 参照文献[12]方法将CaCl2改为NH4Cl而且不加AcOH后,TLC分析发现,除了产物点外还有一个杂质点。我们认为,在没加AcOH的情况下,体系酸度不够,反应不彻底,有部分产物停留在中间体状态。由此认为加酸对该反应是必要的,故尝试在反应约30 min后再添加AcOH的分段投料方法。该方法不仅收率超过84.0%,而且能直接得到纯品。究其原因,是因为此种投料方式,不仅解决了Zn粉和原料附着在瓶壁的关键问题,而且调整了反应体系不同阶段的酸度,保证了硝基的彻底还原。

表1 4的制备条件与结果

a1 4.8 mmol，b1 24.0 mmol,其余反应条件同1．2(3)

表2 3a的制备条件与结果

a2a1.6 mmol,b2a3.2 mmol,c2a10.1 mmol,其余反应条件同1.2(3)

表3 3c的制备条件与结果

a2c1.6 mmol,b2c6.3 mmol,c2c30.0 mmol,d2c26.4 mmol,其余反应条件同1.2(3)

(5)3c：2b按照Zn/NH4Cl/AcOH还原法可以高收率地得到产物3b,但2c同法还原制备3c,收率最高只有45.2%。为了高收率地得到3c,尝试了Zn/CaCl2还原法，结果结果表明，Zn/CaCl2还原法同样适宜于3c的合成。

(6) 6c： Zn/NH4Cl/AcOH和Zn/CaCl2还原法都有较强的还原能力,本文采用Zn/NH4Cl/AcOH体系对5c还原为6c，获得了成功,结果见表4。

表4 6c的制备条件与结果

a5c1.2 mmol，b5c2.4 mmol,c5c4.8 mmol,其余反应条件同1．2(3)

综上所述，从硝基苯甘氨酸及其衍生物还原目标分子,看起来很简单,但制备中却出现不少困难。起初的收率大多低于45%,且产物很难纯化。通过条件探索,可以稳定地获取高纯度高收率的目标分子,为后续研究奠定了基础。

2．2 生物活性结果

测定了1～6的PPRE数据来判定其抗糖尿病的活性，结果见表5。表5显示，在测定浓度极低的条件下,其中6个化合物依然显示出一定的PPRE激动活性；5个化合物的生物活性达到了10.0%以上(3c和6c的活性分别达到了30.0%和22.8%)；2b,2c和3a的活性相近(14.0%左右)；5c和3b活性依次降低。分子结构的ChemDraw3D模拟(Chart 1)发现,3c和6c的芳香环处于不同平面内,具有一定的刚性,与吡格列酮有一定的相似性，但是活性差别很大。郭宗儒等[15]指出,配体分子要表现出好的PPARγ活性,必须以U形构象结合在PPAR受体腔内。因此我们推测：3c和6很可能没有以U形构象进入受体腔,因而显示出很低的PPRE激动活性。这些结果提醒我们,要获取活性好的抗糖尿病分子,结构上要尽可能与具有强的PPARγ激动活性的L-酪氨酸衍生物的结构特征一致,亦即必须在3c和6c的苯环氨基引入疏水结构单元。按此思路,作者合成了另外一些L-间氨基苯甘氨酸的苯环氨基修饰物,多种模型上的抗糖尿病活性研究显示,某些分子的活性确实增强(结果另文发表)。

表5 化合物的PPRE活性数据*

Chart 1

3 结论

以L-苯甘氨酸为原料,合成了9个L-苯甘氨酸衍生物，其中5个为新化合物。工艺研究结果表明，该方法具有合成方法简便、成本低廉、收率稳定优良等优点,具有较高的工业应用价值。

致谢：亢为和王宁老师测定IR和NMR,在此深表谢意！

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