杆状病毒SeMNPV Se29基因的克隆、表达与抗体制备

李赛男,李朝飞, 庞 义, 杨 凯

(1. 肇庆学院生命科学学院, 中国 肇庆 526061; 2. 中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 中国 广州 510275)

甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodopteraexiguamulticapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)属于昆虫杆状病毒科核多角体病毒属．杆状病毒是一类双链DNA 病毒，是感染昆虫和其它节肢动物的主要病原，具有高度的宿主专一性[1]．SeMNPV的宿主昆虫甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布的多食性害虫，自20世纪90年代以来曾相继在广东、云南、江西、湖南、浙江、江苏、台湾等多种蔬菜及棉花、大豆、甜菜等经济作物上暴发性发生，对当地农业生产造成重大损失，而且随着广谱杀虫剂的大量施用和滥用，甜菜夜蛾对许多农药产生了抗性，多类化学农药已对其失去防治效果．研究表明，SeMNPV能有效防治甜菜夜蛾，对控制甜菜夜蛾具有潜在的发展前景，已被成功开发为生物杀虫剂用于防治甜菜夜蛾[2-3]．但是昆虫病毒种间的遗传变异较大，宿主专一性强，杀虫速度缓慢，故限制了它们的应用[4]．为此，深入研究SeMNPV分子生物学，构建高杀虫毒力的重组病毒杀虫剂，具有重要的理论意义和广阔的应用前景．

自苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV) 的全基因组序列被测定以来[5]，至今已有50株杆状病毒的全基因组序列被测定．其中，46株病毒的宿主是鳞翅目昆虫，膜翅目昆虫病毒3株，1株双翅目昆虫病毒[6]．BLAST搜索并Clustal W比对发现，Se29所编码的氨基酸序列与SpodopterafrugiperdaNPV ORF28、AgrotissegetumNPV ORF30、SpodopteralituraMNPV ORF119、HelicoverpaarmigeraSNPV ORF128、AcMNPV ORF17和BombyxmoriNPV ORF9所编码的氨基酸序列一致性分别为46%、43%、27%、25%、10%和9%．有研究表明，BombyxmoriNPV ORF9(Bm9) 是一个早期基因，在病毒感染后3 h开始转录，表达产物存在于被感染细胞的细胞质中，AcMNPV ORF17(Ac17) 是晚期基因，其表达产物存在于被感染细胞的细胞质和细胞核中，Bm9和Ac17的缺失均不影响病毒DNA的复制，但是降低了芽生型病毒粒子(Budded virus, BV)的生产水平[7-8]．HelicoverpaarmigeraSNPV ORF128(Ha128)基因是一个晚期表达基因，其表达产物HA128位于被感染细胞的细胞质中，与宿主蛋白发生相互作用，可能在病毒的侵染过程中发挥作用[9]．SE29与HA128同源性较高，其是否具有与HA128相同功能以及其在病毒侵染过程中的作用值得关注．到目前为止，有关Se29及其其它同源基因的分子生物学特性和功能的研究尚未见报道．本文为了深入研究Se29基因的结构与功能关系，在大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21( DE3)中表达了SE29蛋白，电泳纯化后免疫家兔，制备了多克隆抗体，为进一步研究SE29蛋白的功能奠定了基础．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 甜菜夜蛾核多角体病毒毒株SeMNPV-SeUS1由美国California University, Riverside分校的Dr. Federici B A惠赠；E.coli菌株BL21 (DE3 )由中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室保存；克隆载体pMD18-T 购自TaKaRa公司；表达载体pET-28a(+) 购自Novagen公司；甜菜夜蛾细胞系Se301由日本的Dr. Kawarabata惠赠，细胞维持于添加了体积分数为10%的胎牛血清(全文同)的Grace’s 培养基中，培养温度为28 ℃．

1.1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒和DNA回收试剂盒购自Omega公司； 6×His-tag表达试剂盒(QIA expressionistTM)购自Qiagen公司；Taq酶购自上海生物工程公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶、丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺为Promega产品；DNA相对分子质量、蛋白质相对分子质量标准、IPTG和X-gal等试剂均为东盛生物工程公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Gibco BRL公司；其它试剂为国产分析纯．

1.1.3 仪器 PCR 扩增仪、凝胶成像系统、聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质转印系统装置购自美国Bio-Rad 公司，台式高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品．

1.1.4 培养基 采用常规固体或液体LB培养基培养大肠杆菌，昆虫细胞培养基为添加了10%胎牛血清的Grace’s 培养基．

1.2 方法

1.2.1SeMNPV基因组DNA的提取SeMNPV基因组DNA的提取参照文献[10]的方法进行．

1.2.2 引物设计及PCR 根据SeMNPV 基因组全序列[11](Genbank accession No. NC_002169)，运用DNASTAR软件设计一对扩增Se29基因全长的引物，由上海英骏生物技术有限公司合成．上游引物Se29-P1：5′-GGATCCATGTTTGAATTCGATAAAGATTTTA-3′(下划线部分为引入的BamHⅠ酶切位点)；下游引物Se29-P2：5′-AAGCTTTTACATTTTACCTACACCATAAC-3′(下划线部分引入的HindⅢ酶切位点)．PCR反应体系为50 μL，模板为SeMNPV基因组DNA．PCR反应设计为：94 ℃预变性，3 min，1次；94 ℃变性，1 min，50 ℃退火，1 min，72 ℃延伸，1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min后移至4 ℃存放．扩增完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对Se29基因的PCR产物进行回收．

1.2.3Se29基因原核表达质粒的构建 原核表达重组载体的构建策略如图1所示．DNA回收和质粒提取按照试剂盒操作说明进行．酶切、连接、转化等步骤均按文献[12]进行．重组表达质粒pET-Se29经过酶切鉴定后，在上海英骏生物技术有限公司对插入的DNA片段测序，鉴定插入片段的正确性．

1.2.4Se29基因在E.coli中的表达 将经测序鉴定后的重组质粒pET-Se29转化E.coliBL21(DE3)，挑取含pET-Se29的单克隆接种于3 mL LB 培养基中，37 ℃过夜培养后，次日以1%转接，37 ℃振摇至OD600=0.5，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37 ℃诱导5 h，收集菌体进行12%(体积分数)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和Western印迹分析，方法参照QIA expressionistTM说明书进行．

1.2.5 抗体的制备 参照文献[12]的方法，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，按文献[13] 的方法制备抗体．从15～ 20 块SDS-PAGE胶上割取所需要的目的带，研磨成匀浆反复通过7号注射针头，纯化的融合蛋白与等体积的弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体．

1.2.6 抗体的检测 取SeMNPV感染72 h后的Se301细胞，用SE29多克隆抗体按Western免疫印迹试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)说明进行Western blot分析．抗体以1∶1 000用1×封闭液稀释．

2 结果

2.1 原核表达质粒的构建

M：DNA相对分子质量标准；1：PCR产物；2：重组质粒T-Se29的BamHⅠ/HindⅢ双酶切；3：重组质粒pET-Se29的BamHⅠ/HindⅢ双酶切图2 PCR产物、重组质粒T-Se29和pET-Se29的鉴定

用引物Se29-P1和Se29-P2从SeMNPV基因组中扩增了Se29基因，扩增片段共642 bp，与预期大小相符(图2，泳道1)．回收PCR产物，连入pMD18-T克隆载体，得到质粒T-Se29，进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，获得与预期大小一致的642 bp的目的片段和2.692 kb的载体片段(图2，泳道2)．以BamHⅠ和HindⅢ酶切T-Se29，回收Se29基因片段，连接到同样双酶切的pET-28a(+)上，得到质粒pET-Se29，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，获得与预期大小一致的642 bp的目的片段和5.369 kb的载体片段(图2，泳道3)．测序结果表明，插入片段与NCBI上公布的该片段序列完全一致，而且Se29基因与载体pET-28a(+)连接正确．

2.2 Se29在E.coli中的表达

将重组表达质粒pET-Se29转入E.coliBL21(DE3)，以IPTG诱导5 h，离心收集细胞，进行SDS-PAGE．结果表明，产生了大小约为27 000 的特异性蛋白条带，Se29基因编码213个氨基酸，翻译产物理论相对分子质量为24 400，本实验所表达蛋白的大小比预期大小略大；而经诱导的E.coliBL21(DE3)和未经诱导的含重组表达质粒pET-Se29的E.coliBL21(DE3)在相应的位置上没有出现诱导的蛋白带( 图3 )．以Ni-NTA碱性磷酸酶偶联抗体进行Western blot分析，在硝酸纤维膜上检测到相对分子质量约为27 000的蛋白条带，而同时转印的对照样品则检测不到任何蛋白条带(图4)，表明诱导的目的蛋白成功地进行了融合表达，并在N-端携带有6×His接头．

M：蛋白质相对分子质量标准；1：经IPTG诱导的BL21(DE3)；2：未经IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-Se29；3：经IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-Se29图3 SE29蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达的SDS-PAGE

M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：经IPTG诱导的BL21(DE3)；2：未经IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-Se29；3：经IPTG诱导的BL21(DE3)/pET-Se29图4 用Ni-NTA conjugate 抗体检测SE29蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达的Western blot分析

2.3 Se29抗体的制备与检测

M：预染蛋白质相对分子质量标准; 1：未感染病毒的Se301细胞; 2：SeMNPV 感染后的Se301细胞图5 SE29蛋白抗体在病毒感染的细胞中的检测

将从SDS-PAGE胶上割取的融合蛋白免疫新西兰大白兔，3次加强免疫后收取抗血清．制备的SE29抗血清能在SeMNPV 感染72 h的Se301细胞总蛋白中杂交到一条约24 400的特异杂交带，而未感染病毒的对照细胞中没有阳性信号( 图5 )．表明制备的抗体特异性较好，适合用作以后有关Se29功能的研究．

3 讨论

SeMNPVSe29的同源基因广泛存在于已经测定全基因组序列的鳞翅目杆状病毒( NPV) 基因组中．Se29的同源基因Ac17和Bm9的缺失均不会影响病毒DNA的复制，但是降低了BV的产生水平[7-8]．Ha128基因的表达产物HA128与宿主蛋白发生相互作用，可能在病毒的侵染过程中发挥作用[9]．SE29与AC17和BM9的同源性较低，与HA128的同源性较高，其是否具有与HA128相同功能以及其在病毒侵染过程中的作用值得关注．

本论文通过PCR 的方法从SeMNPV 基因组中扩增得到Se29基因，构建了Se29基因的原核表达质粒，在大肠杆菌中实现了SE29蛋白的融合表达，跟预期大小相比蛋白稍微变大．由于原核表达载体pET-28a(+)的N 端携带有6×His Tag 序列，表达的蛋白在其N-端均带有融合的6×His接头，这可能是蛋白稍微变大的原因．用表达的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备了SE29蛋白的多克隆抗体．Western blot分析表明，SE29蛋白的多克隆抗体与SeMNPV感染的Se301 细胞总蛋白显示一条相对分子质量约24 400的特异杂交带，与推测的大小一致，而对照细胞中没有出现相应的带，表明所制备的抗体是成功的．这是因为在病毒感染的真核细胞中，蛋白没有6×His 接头，在原核细胞中表达后的可能的结合或修饰被去除，显示了蛋白自身的预测大小．该抗体的制备为进一步研究SE29 蛋白在病毒结构和感染细胞中的定位、相互作用蛋白的鉴定以及Se29基因在病毒侵染过程中的可能作用奠定了基础．

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