一株嗜热菌的分离、鉴定及海藻糖合成酶基因的克隆

王慧荣 韦宇拓,黄日波

(1.浙江省环境保护科学设计研究院,中国 杭州 310007；2. 广西大学生命科学与技术学院，中国 南宁 530005；3.广西科学院，中国 南宁 530003)

自从在水生栖热菌里发现了DNA聚合酶，促进了生物学发展和嗜热酶的商业开发和应用以后，人们不断寻找新的嗜热菌，不仅为了研究嗜热菌的嗜热机理，更多的是寻找有应用价值的嗜热酶．由于嗜热酶有热稳定性和在高温下有最佳活力的特点，在造纸工业、环护、能源利用、烟草业、石油开采、液体燃料的生产、生物转化及抗生素生产等领域都有广泛的应用[1-2]．嗜热酶的广泛应用促使人们不断寻找新的嗜热菌．海藻糖(trehalose)是细胞在不良环境中所产生的一种重要的抗逆应激物，在环境胁迫条件下对生命体和生物活性物质具有保护功能，在食品工业、农业、医药工业、分子生物学等领域有广泛的应用前景[3]．虽然目前，已从ThermusaquaticusATCC33923、ThermusthermophilusHB8等多种嗜热菌中克隆了海藻糖合成酶编码基因(treS),并且进行了异源表达[4-5]．但是嗜热菌来源的海藻糖合成酶分子量一般较大，表达量不高，需要解决密码子偏爱性等问题以提高在大肠杆菌中的表达量．由于海藻糖合成酶三维晶体结构的研究还未见报道，缺乏足够的数据详细阐述它的催化机理，通过空间分子结构的改造来改善酶学性质的研究有一定的困难，目前亟需大量的关于海藻糖合成酶的序列、结构和生物学特性等相关数据．

本文从广西热泉中分离到一株嗜热菌，初步鉴定它为Thermusthermophilus，对该菌的海藻糖合成酶基因进行了初步探索，为构建高产海藻糖合成酶的工程菌提供理论基础及重要的实验依据；另一方面，也进一步丰富不同微生物中该酶基因序列和结构方面的信息．

1 材料和方法

1.1 样品采集与处理

从广西贺州市西鸡镇80 ℃，pH为6.7，含盐量2 g/L的热泉中采集水样和泥样．水样以12 000 r/min离心10 min，收集菌体；泥样用泉水彻底悬浮后，以500 r/min离心2 min，去除大颗粒的杂质，然后再用处理水样的方式处理上清液富集菌体．

1.2 菌株、载体及试剂

大肠杆菌JM109由本实验室保存，PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，限制性内切酶，T4DNA连接酶，pMD 18-T vector购自宝生物工程(大连)有限公司，其他试剂均为国产分析纯．

1.3 培养基

分离培养基[6]:NaCl 1 g，MgCl2·6H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，CaCl20.23 g，KCl 0.5 g，KH2PO40.42 g，(NH4)2SO40.1 g，NaBr 0.05 g，SrCl2·6H2O 0.02 g，NaHCO31 g，Yeast extract 1 g，Tryptone 1 g，肉汁胨0.5 g，FeCl3(100 g/L) 10 mL，1 000×Vitamin Solution 10 mL，Trace element solution 1 mL，NaOH调pH值至7.0，1×105Pa 灭菌30 min．Vitamin Solution用0.45 μm滤膜过滤，固体培养基加20 g琼脂．

1.4 嗜热菌的分离与培养

取处理好的样品直接涂布于固体培养基上，分别置于75 ℃和80 ℃培养箱中培养，待菌落长出后，挑取单个菌落进行划线培养，分别置于85 ℃，86 ℃，87 ℃下培养24～48 h.筛选能在最高温度下生长的菌，从而实现菌株的分离与纯化．为防止温度过高在培养过程中平板脱水干裂，在培养时将平板倒置放在一个10 L的玻璃器皿中，里面放置1杯水，每天定期打开玻璃器皿通氧．

1.5 形态观察和培养条件

1.5.1 形态观察 固体培养基上培养了24～48 h的单菌落，用电子显微镜观察细胞形态，革兰氏染色光学显微镜观察．

1.5.2 培养温度 接种一个单菌落到10 mL液体培养基中，培养使其OD600达到0.6～0.8时，以2%的接种量接种到100 mL，pH为7.0的液体培养基中，在220 r/min条件下，分别置于55、60、65、70、75、80、85 ℃下，每隔2 h取1.5 mL菌液测定OD600．

1.5.3 培养pH值 同样以2%的接种量接种到100 mL, pH值分别为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的液体培养基中，70 ℃，220 r/min条件下，每隔2 h取1.5 mL菌液测定OD600．

1.5.4 NaCl浓度的测定 以2%的接种量接种到100 mL NaCl质量浓度分别为0，4，8，10，12 g/L，pH值为7.0的液体培养基中，在75 ℃，220 r/min条件下培养．每隔2 h取1.5 mL菌液测定OD600．

1.6 G+C 物质的量浓度和抗生素敏感性的测定

用溶解温度(Tm)法[7],参照文献[8] 的浓度进行测定．

1.7 16S rRNA基因的PCR扩增、序列测定和系统发育分析

取对数期的菌液，离心后收集菌体，CTAB法提取总DNA．依照细菌16S rRNA基因扩增的通用引物：F27(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)，R1522(5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3)，以TTH总DNA为模板，PCR反应条件：94 ℃变性4 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共25个循环，72 ℃延伸6 min．PCR产物纯化后连接到 pMD 18-T vector，经过抽提质粒和酶切验证酶连接产物正确，委托上海基康生物技术有限公司进行测序．将得到的16S rRNA序列与GenBank中的核酸数据进行BLAST比对，选取与其同源性达到98%的相关序列．采用软件ClustalX对所获得的核苷酸序列进行序列比对，用软件MEGA4.1计算出序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统进化树．

1.8 treS基因的扩增

根据GenBank中已公布的模式菌株ThermusthermophilusHB8的treS基因序列设计引物，引物1：5′- TGGTAAACCCGCTCCCACAG -3′，引物2：5′- TGCCTGGGCACGGAAAAGAA-3′．以TTH总DNA为模板，PCR条件为94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 30个循环后72 ℃延伸10 min．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后进行胶回收，与pMD 18-T vector 4℃过夜连接，将连接产物转化E.coliJM109，蓝白斑筛选，筛选阳性克隆，菌落PCR检测目的条带，提取阳性菌的质粒．酶切鉴定，测序由上海基康生物技术有限公司完成．

图1 菌株TTH的电镜照片(×10 000)

2 结果

2.1 形态和培养特征

菌株TTH为革兰氏阴性的杆状细胞，大小为(0.4～0.6)μm×(3.0～4.5)μm，无鞭毛、芽孢．培养48 h的菌落呈圆形，中间稍有凸起，边缘整齐，表面光滑，有光泽，浅黄色，不透明．电镜照片见图1．

2.2 温度对TTH生长的影响

菌株TTH的生长温度范围是55 ℃～85 ℃，低于55 ℃，高于85 ℃都不生长，在55 ℃，85 ℃下生长极度贫乏，最适生长温度是70 ℃左右，培养约12 h进入稳定期．结果见图2．

2.3 pH对TTH生长的影响

菌株TTH生长pH值的范围是5.0～9.0，在5.0，5.5和9.0下生长十分缓慢，低于5.0，高于9.0条件下不生长．最适的生长pH值为6.5～7.5，结果见图3．

图2 温度对菌株TTH生长的影响

图3 pH对菌株TTH生长的影响

图4 NaCl质量浓度对菌株TTH生长的影响

2.4 NaCl对TTH生长的影响

TTH菌株生长的NaCl质量浓度范围是0～12 g/L，在12 g/L NaCl浓度下生长贫乏，大于12 g/L NaCl不生长，最适的NaCl浓度是0～4 g/L．结果见图4．

2.5 G+C物质的量分数和抗生素敏感性

菌株TTH的G+C物质的量分数为67.6%．参照文献[9]，加氨苄青霉素、氯霉素到液体培养基中，使其终浓度为10 mg/L，70 ℃，24 h未见生长．在加了链霉素、卡那霉素的培养基中，链霉素、卡那霉素的终浓度在50 mg/L时，菌株都可以生长．四环素10 mg/L时不抑制生长，100 mg/L时可完全抑制生长．

2.6 以16S rRNA序列为基础的系统发育分析

菌株TTH 16S rRNA全序列总共1 478个碱基，在GenBank登录号为EU616794.1．将其序列在GenBank中进行BLAST比较，发现菌株TTH与多株栖热菌属(Thermus)的16S rRNA序列同源性高达98%，依据此结果，菌株可归属于栖热菌属(Thermus)．选择BLAST比对结果中相似度最高的5条16S rRNA，利用ClustalX 1.8和 MEGA4.1软件，采用邻位相连法构建系统发育树．图5表明菌株TTH与Thermusthermophilus的3株菌在同一族上，其中与ThermusthermophilusXM、Thermusthermophilusit-1、Thermusthermophilus这3株菌的同源性高达98%，结合形态学观察、生理生化特征指标测定及16S rRNA序列分析结果，确定菌株TTH是栖热菌属中的Thermusthemophilus．

图5 菌株TTH的系统发育进化树

1: treS gene; M: DL2000 Marker图6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.7 treS基因的扩增

以TTH的总DNA为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增treS基因，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图6所示．

从图6中可以看出PCR扩增出了约1 200 bp的片段，将PCR产物与pMD 18-T vector连接后，转化E.coliJM109，蓝白斑筛选，菌落PCR和酶切验证正确后，对treS基因进行测序，其结构基因全长为1 250 bp，GenBank accession:GQ175175，测序结果在GenBank中Blast进行比对，发现它与菌株ThermusthermophilusRQ-1，Thermuscaldophilus，ThermusthermophilusHB8，Thermusthermophilus的treS基因的同源性最高可达87%，作者克隆的该菌的treS基因有可能是海藻糖合成酶的同源基因，treS基因的获得为TTH菌株完整的treS基因的克隆奠定了基础．

3 讨论

早在1971年日本人就从当地55 ℃～85 ℃的热泉中分离到了Thermusthemophilus，从此对该菌进行了大量的研究，但是已知的Thermusthemophilus大多从海洋热泉中分离得到，能够耐盐[10]．本文从陆地热泉中分离的TTH菌株生长的NaCl质量浓度范围是0～12 g/L，在12 g/L NaCl浓度下生长贫乏，NaCl浓度大于12 g/L时不生长，最适的NaCl浓度是0～4 g/L．在Thermusthemophilus里有好氧菌和厌氧菌，菌株TTH是好氧菌，文献中HB27只能在好氧条件下生长，HB8不仅可在好氧条件下生长，还能在硝酸盐存在的条件下厌氧生长．与TTH硝酸盐还原反应阴性相一致，可见在自然界中存在多种不同的Thermusthemophilus菌株[11]．由此可以看出嗜热微生物资源相当丰富，还有很大的探索空间，筛选出更多的嗜热菌不仅可以丰富嗜热微生物资源，还为研究嗜热菌机理提供了实验素材．

本实验室通过DNA Shuffling技术寻求新的耐高温海藻糖合成酶基因的研究已经多年，从已报道的Thermusthermophilus不同菌株中克隆了海藻糖合成酶基因[12]，但是从嗜热菌TTH中克隆的treS基因与这些菌中存在的海藻糖合成酶基因还是有差异的，且测定的序列与已报道的ThermusthermophilusRQ-1，Thermuscaldophilus，ThermusthermophilusHB8，Thermusthermophilus的treS基因的同源性最高达87%，由此作者认为Thermusthermophilus的treS基因序列既有保守性，又有在不同环境条件胁迫下产生的进化差异性．对菌株TTH的treS基因序列进行进一步的分析，将会为理解该酶的作用机制，以及该酶在不同细菌中的进化演变情况提供有价值的参考．

参考文献：

[1] LI J B, XU L M, YANG F. Expression and characterization of recombinant thermostable alkaline phosphatase from a novel thermophilic bacteriumThermusthermophilusXM[J].Acta Bioch Bioph Sin, 2007,39(11):844-850.

[2] MITSUNORI I, SATOSHI K, ATSUSHI K,etal. Purification and characterization of the recombinantthermussp. strain T2α-galactosidase expressed inEscherichiacoli[J]. Appl Environ Microb, 2001,67(4):1601-1606.

[3] EIBEIN A D, PAN Y T, PASTUSZAK I,etal. New insights on trehalose: a multifuntional molecule[J].Glycobiol，2003, 60(13):17-27.

[4] TSUSAKI K, NISHIMOTO T, NAKADA T,etal. Cloning and sequencing of trehalose synthase gene fromthermusaquaticusATCC33923[J].Acta Bioch Bioph Sin, 1997,1334(45):28-32.

[5] ZDZIEBLO A, SYNOWIECKI J. Production of trehalose by intramolecular transglucosylation of maltose catalysed by a new enzyme fromThermusthermophilusHB-8[J]. Food Chem, 2006,96(6):8-13.

[6] WOESE C R， KANDLER O， WHEELIS M L. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea， Bacteria, and Eucarya[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1990, 87:4576-4579.

[7] 阮继生，刘志恒，梁丽糯，等. 放线菌研究及应用[M]. 北京: 科学出版社, 1990.

[8] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇.分子克隆实验指南[M].金冬雁,黎孟枫，译.2版.北京：科学出版社,2001:548.

[9] 王慧荣，韦宇拓，黄日波.一个新型嗜热菌质粒的测序鉴定及抗生素抗性研究[J].湖南师范大学自然科学学报，2010，33(2)：102-106.

[10] SANDRA T M, FRENANDA N, FRED A R,etal.Thermonemarossianumsp. Nov., a new thermophilic and slightly halophilic species from saline hot springs in Naples, Italy[J]. Int J Syst Bacterilol, 1997,47(1):122-126.

[11] FELIPE C, OLGA Z, AXEL M,etal. A new type of NADH dehydrogenase specific for nitrate respiration in the extreme thermophilethermusthermophilus[J]. J Biol Chem, 2004, 29(24):45369-45378.

[12] 韦传东．海藻糖合成酶基因的融合表达、纯化以及酶学性质研究[D]. 南宁：广西大学,2006.