Lrrc10蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

闵 璐，周云雷，周 煌，吴秀山，袁婺洲

(湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室，心脏发育研究中心，中国 长沙 410081)

Lrrc10 (Leucine-rich Repeat Containing protein 10)是第一个被报道的具有心脏特异性表达的LRR(leucine-rich repeat，富亮氨酸重复序列)家族蛋白．近年来，多个实验室对小鼠Lrrc10 基因进行了研究报道，它是一个无内含子的基因，在小鼠心脏组织中有大量的特异性表达．Lrrc10在小鼠胚胎期心脏的表达部位与NKX2-5/CSX(cardiacspecifichomeobox)表达极其相似，亚细胞定位实验显示Lrrc10在细胞质与细胞核都有表达，进一步分离的新生大鼠心肌细胞实验证明了是在Z-线上和横小管上表达[1]．RNA干扰斑马鱼Lrrc10 后，斑马鱼胚胎的心脏不能正常环化，心脏收缩因子cmlc-2(cardiacessentialmyosinlightchain-1)的表达下调，胚胎发育6～7天后死亡．这说明Lrrc10 对于斑马鱼胚胎期心脏的形成和功能至关重要[2]．

但是Nikolay指出[3]，Lrrc10 敲除小鼠的心脏发育并没有出现异常现象，Lrrc10基因对于小鼠心脏的发育并非必需．也许是因为小鼠心脏发育的复杂程度高于斑马鱼，Lrrc10蛋白在小鼠心脏中的缺失，可能有其他同源性较高的功能相似的蛋白起到了代偿作用，具体原因有待进一步研究．

同时，人类与小鼠的Lrrc10 基因在氨基酸水平的相似性高达84%．Lrrc10在人类心脏组织中也特异性表达．虽然小鼠Lrrc10 基因敲除后对心脏发育和功能没有影响，但是并不代表其在心脏发育过程中没有作用．利用DMSO诱导P19CL6细胞分化研究表明：Lrrc10基因在P19CL6细胞分化第3天开始表达，说明Lrrc10基因可能与心肌分化相关．本实验通过制备Lrrc10融合蛋白表达载体，成功免疫新西兰大白兔，获得效价高、特异识别Lrrc10蛋白的多克隆抗体，为深入研究Lrrc10在心肌分化中的功能奠定了基础．

1 材料与方法

1.1 主要试剂

大肠杆菌BL21菌种，pGEX-4T-1菌种以及DH5α菌种为本实验室保种； pMD18-T载体和连接酶购自大连宝生物公司；RNase购自Sangon公司；10×Loading buffer、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ购自深圳晶美公司；质粒提取试剂盒(离心柱型)购自OMEGA；UNIQ-10柱式DNA 胶回收纯化试剂盒购自上海生工公司；柱式DNA胶回收试剂盒购自TIANGEN；蛋白胨、甲叉双丙烯酰胺、酵母提取物、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)丙烯酰胺、氯化钠、过硫酸铵等购自上海生工公司；Glutathione SepharoseTM 4B购自Amersham Biotech 公司；弗氏完全佐剂、不完全佐剂购自Sigma公司．

1.2 引物设计与合成

根据巢式PCR的原理和Lrrc10基因的序列设计引物.第一对引物：Z-Lrrc10上游引物: 5′GTTGGT GGGCAGGGGCTCGCC 3′Z-Lrrc10下游引物: 5′AGCAATTCAGAGGACCCAT 3′；第二对带有酶切位点的引物：Z-Lrrc10上游引物 :5′GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCT 3′EcoRⅠ，Z-Lrrc10 下游引物:5′AGGTCGACACGATTCCGGGAGGACACAGAA 3′SalⅠ由上海生工公司合成．

1.3 基因扩增及克隆

首先以小鼠心脏cDNA文库为模板用第一对引物进行PCR扩增，用第二对引物以第一次PCR产物为模板进行PCR(反应条件为：94 ℃ 变性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2min，30个循环；72 ℃延伸8 min)．纯化PCR产物，获得300 bp的目的片段，然后将其连入T载体，转化入DH5α感受态细胞中，酶切检测筛选出阳性单克隆，经测序鉴定后将DNA片段用EcoRⅠ和SalⅠ从pMD18-T-Lrrc10 质粒上切下，连入相同酶切位点线性化的pGEX-4T-1载体，转入DH5α感受态细胞中，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定后，得到重组表达质粒pGEX-4T-1-Lrrc10．

1.4 Lrrc10融合蛋白的诱导表达

将质粒pGEX-4T-1-Lrrc10转入BL21感受态细胞，挑取单克隆，接种于25 mL含100 mg/L 氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃培养至OD600约为0.6，取1 mL菌液作为空白对照，然后加IPTG诱导，25 ℃继续培养，1、2、3、4、5、6 h各取1 mL菌液，确定最佳诱导时间．

1.5 Lrrc10融合蛋白亲和纯化

离心收集菌液，用PBS重悬菌液后超声裂解，裂解至菌液清亮后离心收集上清．4 ℃条件下加入用PBS活化的谷胱甘肽琼脂糖珠4B，结合后用PBS洗去杂蛋白，加入适当体积的洗脱液混匀，离心收集上清即Lrrc10融合蛋白，保存于-80 ℃．

1.6 Lrrc10多克隆抗体的制备

以新西兰大白兔(约2.0～2.1 kg 雄免)免疫前正常血清为阴性对照(耳缘静脉取血)．将纯化后的GST-Lrrc10蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1∶1在注射器中推成乳剂，分散10～20个点对同一新西兰大白兔进行背部皮下免疫注射．在第一次注射后第14、21、28天，将GST-Lrrc10蛋白按体积比1∶1与弗氏不完全佐剂在注射器中推成乳剂，进行再次免疫．第35天主动脉取血，静置过夜(4 ℃)，3 000 r/min离心处理10 min，取上清分装保存(-80 ℃)．

1.7 Lrrc10多克隆抗体的检测

收获免疫兔血清，用小鼠心脏组织蛋白进行Lrrc10抗体的效价测定，设置抗体稀释浓度分别为1∶50和1∶100．根据效价测定后的结果进行抗体特异性检测，提取小鼠多组织蛋白，进行SDS电泳和免疫印迹分析．Lrrc10抗体以1∶100用1×封闭液稀释．

2 结果

A:EcoRⅠ/SalⅠ双酶切结果;B:pGEX-4T-1-Lrrc10质粒示意图图1 双酶切鉴定及pGEX-4T-1-Lrrc10质粒示意图

2.1 Lrrc10基因表达载体的构建

用第二对引物扩增得到Lrrc10基因部分序列(第628个碱基到927个碱基)，将该目的片段克隆到一级载体pMD18-T，通过双酶切质粒pMD18-T-Lrrc10获得目的片段后连入线性化的pGEX-4T-1载体，转入DH5α感受态细胞．双酶切鉴定(如图1A)及测序分析显示已成功构建了质粒pGEX-4T-1-Lrrc10 (图1B)．

2.2 Lrrc10融合蛋白的表达及纯化

将重组子转化入BL21感受态细胞，用0.2 mol/L的IPTG在25 ℃条件下进行诱导，1、2、3、4、5、6 h各取1 mL菌液进行检测，可见一条相对分子质量约为37 000大小的特异性条带，与预期的GST-Lrrc10相对分子质量一致(如图2)．

1:pGEX-4T-1-Lrrc10 未诱导蛋白表达；2:0.2 mmol/L IPTG 诱导pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表达1 h;3：0.2 mmol/L IPTG 诱导pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表达2 h;4：0.2 mmol/L IPTG 诱导pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表达3 h;5：0.2 mmol/L IPTG 诱导pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表达4 h;6：0.2 mmol/L IPTG 诱导pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表达5 h;7：0.2 mmol/L IPTG 诱导pGEX-4T-1-Lrrc10 蛋白表达6 h;M：#0671图2 Lrrc10蛋白的原核表达

M，#0671；诱导蛋白，0.2 mmol/L IPTG 诱导pGEX-4T-1-lrrc10 5 h时蛋白；纯化蛋白，谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化后蛋白图3 融合蛋白GST-Lrrc10的纯化图

选定诱导的优化条件为，25 ℃ 下生长至OD600值为0.6～0.8，用0.2 mmol/L 的IPTG 诱导表达5 h时所得到的蛋白质量最多且为可溶蛋白，融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化后，通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后显示目的条带纯度较高，可进行蛋白免疫(如图3)．

2.3 免疫印记鉴定Lrrc10多克隆抗体

用自制的Lrrc10多克隆抗体作为一抗进行Western blot检测，在GST-Lrrc10蛋白所在位置存在特异性条带(如图4)，说明此兔抗血清中含有Lrrc10的特异性抗体并且该抗体的特异性和敏感性均达到实验需要．

2.4 Lrrc10在小鼠组织中表达检测

提取小鼠成体心脏、肝脏、大脑、肺、肾、胃以及小肠等组织蛋白，用制备的多克隆抗体检测这些组织中Lrrc10蛋白的表达情况．从Western blot 检测结果发现，Lrrc10在心脏有较强而且特异性的表达，在脑中有微弱表达(如图5)．

1：抗原为小鼠心脏蛋白，一抗为免疫前兔血清；2、3：抗原为纯化蛋白，一抗比例分别为1∶50和1∶100；4、5：抗原为小鼠心脏蛋白，一抗比例分别为1∶50和1∶100图4 Lrrc10 多克隆抗体Western-blotting鉴定

图5 Lrrc10 在成年小鼠各个组织表达检测

3 讨论

作为LRR家族一员的Lrrc10蛋白含有4个LRR 保守结构域，LRR 结构域在蛋白质相互作用中起重要作用．众多研究表明含有此结构域的蛋白质可参与多种生物过程，如信号转导、细胞粘性、转录活性的调控、DNA 修复、激素受体作用以及免疫反应等[4-7]．LRR 家族的蛋白质还有更多功能等待研究．

在制备此抗体过程中，作者运用的是pGEX-4T-1载体[8-10]．运用pGEX表达载体时，存在一个难点，即必须保证其目的基因在上清中表达，此时产物(谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因的融合蛋白)才可用Glutathione SepharoseTM 4B珠子进行纯化．为消除这一问题，可改用pET-28a表达载体．pET-28a载体与其他表达载体不同之处在于其C，N两端均含编码Histag标签的蛋白序列，如一端有移码突变，能保证目的蛋白仍带有Histag标签蛋白，并且不论目的蛋白在上清或沉淀表达，都可用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化获得有活性的目的蛋白．

本实验中,作者通过构建原核表达载体pGEX-4T-1-Lrrc10获得GST-Lrrc10蛋白．最终免疫新西兰大白兔获得了Lrrc10抗体．通过免疫印迹等方法证明制备的Lrrc10多克隆抗体能特异结合生物体内表达的Lrrc10蛋白． 因此,它为将来运用染色质免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫组化等手段深入研究Lrrc10基因的功能奠定了基础．

参考文献：

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