橄榄叶提取物对大鼠急性炎症和痛觉过敏的研究

耿成燕，宫德正，姜丽平，曹 军，Hiroyuki Yoshimura，仲来福*

1大连医科大学中日合作医药科学研究所，大连116044，2日本卫材株式会社食品与化学部，东京103-0027

橄榄叶提取物对大鼠急性炎症和痛觉过敏的研究

耿成燕1，宫德正1，姜丽平1，曹 军1，Hiroyuki Yoshimura2，仲来福1*

1大连医科大学中日合作医药科学研究所，大连116044，2日本卫材株式会社食品与化学部，东京103-0027

本文采用鹿角菜胶诱导的大鼠急性炎症模型观察橄榄叶提取物(OLE)的抗炎与镇痛作用及对致炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达。用鹿角菜胶注射到大鼠右后足内，分别于鹿角菜胶注射前30 min和注射后120 min灌胃给予OLE 100、250和500 mg/kg体重。鹿角菜胶处理后测量足跖肿胀度及痛域。用RT-PCR检测足跖垫内组织TNF-α、IL-1β和IL-10的mRNA表达。结果显示，经灌胃给予OLE100、250和500 mg/kg体重，均能明显降低大鼠后足肿胀度，增加痛域，并明显降低致炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达。本研究提示OLE具有抗炎和镇痛作用，其作用机制可能与抑制TNF-α和IL-1β的mRNA表达有关。

橄榄叶提取物、痛域、肿胀度、鹿角菜胶、炎症、大鼠

橄榄属木樨科，常绿阔叶乔木，又名洋橄榄、齐新果。欧洲原产，我国引种，多栽培于长江以南。橄榄叶提取物(olive leaves extract，OLE)是从橄榄叶中提取的天然酚类物质，它不仅有非常强的抗氧化作用［1］，而且能抗动脉粥样硬化及预防癌症［2］，也有学者报道，它具有降血压、抗微生物等作用［3］。

最近研究表明，橄榄植物水提物能明显降低脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)处理的人单核细胞系(THP-1)和细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的产量［4］。但迄今为止，OLE对鹿角菜胶处理大鼠急性炎症和痛觉过敏的作用，还未见文献报道。本研究的目的在于观察OLE对急性炎症和痛觉过敏的防治作用及其可能机制。

1 实验材料

1.1 药品及试剂

受试物OLE由日本国Eisai食品与化学有限公司(日本国东京市)提供，其组分及含量为糖类占67%、羟基酪醇22%、其他多酚2%、脂质2%、灼烧残渣4%和水1%。鹿角菜胶为Sigma公司产品。试剂盒购自日本TakaRa公司。

1.2 实验动物

清洁级4周龄雄性Sprague Dawley大鼠(由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:辽实动质字［2000］028号)，其初始体重为148～163 g，控制室温(22±2)℃，相对湿度40%～60%，室内12 h光亮，12 h黑暗。动物自由摄食与饮水7 d，使其适应环境并检疫。

1.3 实验仪器

YLS-3E电子压痛仪(山东省医学科学院设备站)、RT-PCR仪(Thermo Electron Co，美国)。

2 实验方法

2.1 动物分组

按体重将大鼠随机分为5组，模型对照组、阳性对照组、OLE 100，250，500 mg/kg体重组，每组10只动物。OLE组分别于鹿角菜胶处理前30 min和处理后120 min灌胃给予相应剂量的OLE。模型对照组灌胃给予相同容量的蒸馏水，阳性对照组腹腔注射给予吗啡12.5 mg/kg体重

2.2 大鼠急性炎症模型建立

给药后30 min，采用注射λ-鹿角菜胶诱发大鼠急性炎症，其方法如下:动物经戊巴比妥钠(30 mg/ kg体重)腹腔注射麻醉后，常规消毒右后足足垫部位，然后用7号注射针向大鼠的右后足足垫部位注入2.0%(W/V)鹿角菜胶0.1 mL，按摩5 min。

2.3 足跖肿胀度测量

诱发急性炎症后210、240、270 min，用容积测量法测定每组大鼠的左右后肢足跖体积(mL)，计算足跖肿胀度(%)。

2.4 痛域的测定

痛域的检测是按照Randall and Selifto’s的方法，使用YLS-3E电子压痛仪仪进行痛域测定。为防止机械损伤，机械压力控制在400 g以内，并在痛域测定前2 d对各组大鼠进行训练。试验时，在给予受试物前，对每组动物进行基础痛域测定。每组动物在鹿角菜胶处理后210、240、270 min，测定其痛域。

2.5 致炎组织细胞因子mRNA表达的分析

随机选取空白对照组、模型对照组和OLE 500 mg/kg体重组各5只动物，在鹿角菜胶处理后270 min处死动物，无菌条件下取大鼠右后足跖垫内组织，采用Trizol法制备总RNA，制备的RNA样品用核酸定量分析仪检测OD260、OD260/OD280的值，并计算RNA产量。采用RT-PCR试剂盒(TaKaRa产品)合成cDNA，使用20 μl体系进行PCR扩增反应，β-actin作为内参，TNF-α、IL-1β和IL-10的引物序列见表1。反应条件如下:94℃预变性1 min，反应30个循环，每循环包括97℃变性20 s、TNF-α和IL-1β 60℃退火20 s，IL-10和β-actin 58℃退火20 s、72℃延伸20 s，最后一个循环72℃保温10 min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml EB)电泳，紫外灯下观察结果并照相。采用BioImaging systems凝胶成像系统(UVP，labworksTM，ver 4.6)计算其灰度值，结果用与β-actin的灰度值的比值表示。

表1 用于实时PCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR analysis

3 统计方法

4 实验结果

4.1 OLE对大鼠右后足跖肿胀度的影响

各组大鼠足跖肿胀度:结果如表2所示。给予各组大鼠不同药物后，吗啡组大鼠右后足跖肿胀度明显小于模型对照组，其差别具有统计学意义(P＜ 0.01)。OLE 100、250 mg/kg和500 mg/kg体重组大鼠右后足跖肿胀度明显小于模型对照组，其差别具有统计学意义(P＜0.05)。

表2 OLE对鹿角菜胶诱发急性炎症模型大鼠右后爪肿胀程度的影响Table 2 Effects of OLE on degree of right hind paw swelling in carrageenan-induced acute inflammation model in rats

4.2 OLE对鹿角菜胶诱导的大鼠痛觉过敏的影响

结果如表3所示。吗啡组痛域均超过400 g，表明吗啡具有明显的镇痛效应。OLE 100、250 mg/kg和500 mg/kg体重组在鹿角菜胶处理后210、240、 270 min的痛域明显高于模型对照组，其差别具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。表明OLE能明显抑制鹿角菜胶诱导的痛觉过敏。

表3 OLE对鹿角菜胶引起的大鼠痛觉过敏的影响Table 3 Effects of OLE on carrageenan-induced hyperalgesia in rats

图1 鹿角菜胶诱发炎症的大鼠右后爪组织细胞因子mRNA表达(OLE处理与未处理组)Fig.1 mRNA expression of cytokines in carrageenaninduced inflamed right paw tissue of rats with or without OLE pretreatment

4.3 OLE对致炎组织细胞因子mRNA表达的影响

结果如图1和图2所示。鹿角菜胶能促进致炎因子TNF-α、IL-1β的mRNA表达，与正常对照组比较，其差别具有统计学意义(P＜0.05)。OLE能明显降低由鹿角菜胶诱导的细胞因子TNF-α、IL-1β的mRNA表达，与模型对照组的差别具有统计学意义(P＜0.05)，但抗炎因子IL-10 mRNA的表达，与模型对照组之间未见具有统计学意义的差别(P﹥0.05)。

5 讨论

本研究结果显示灌胃给予大鼠OLE能明显减轻鹿角菜胶诱导的大鼠右后足跖肿胀度，并首次发现OLE能抑制鹿角菜胶引起的痛觉过敏。

图2 OLE对鹿角菜胶诱发炎症的大鼠右后爪组织细胞因子mRNA表达的影响Fig.2 Effect of OLE on mRNA expression of cytokines in carrageenan-induced inflamed right paw tissue of rats

OLE作为药用已经持续了几个世纪，具有杀菌和对抗真菌的作用［5］，还具有增加巨噬细胞功能和调节炎症反应的作用［6］。OLE是一个混合成分，包括多酚、油橄榄苦素和羟基酪醇等，OLE的活性成分主要来自这些酚类化合物［7］。

有研究证实细胞因子调节中性粒细胞迁移到炎症发生的部位，抗炎细胞因子IL-10可下调这一过程［8］。在动物试验和人的炎症中观察到TNF-α、IL-1β能调节中性粒细胞参与炎症发生，IL-10能抑制炎症刺激诱导的中性粒细胞的迁移［9］。为了证实OLE是否具有抑制致炎细胞因子的产生或增加抗炎因子的作用，我们观察OLE对致炎组织细胞因子mRNA表达的效应。试验结果显示，OLE不仅抗炎和镇痛效应，而且能抑制TNF-α、IL-1β的表达，但IL-10的表达无作用，抗炎细胞因子IL-10的增加有平衡致炎因子的作用，事实上，对由鹿角菜胶引起的炎症，IL-10的作用非常有限［10］。OLE对其他细胞因子是否有作用，有待于进一步的研究证实。

鹿角菜胶不仅诱导局部组织炎症，而且能使系统血细胞产生反应。鹿角菜胶预处理可使LPS诱导白细胞生成TNF-α的作用更明显［11］。在这个模型中OLE能明显减少TNF-α，后者是可活化巨噬细胞和促进炎症反应的关键因子［12］。有研究发现，抑制TNF-α的产生或用TNF-α的抗体处理，对炎症性疾病的治疗都是有效的［13］。

目前研究已经证实OLE具有抗炎和镇痛作用，它可能对人类的炎症疾病有预防和治疗作用，也可能作为炎症疾病治疗的补充，减少致炎细胞因子促进炎症的作用。本研究结果提示，OLE具有抗炎和镇痛作用，其作用机制可能与抑制 TNF-α、IL-1β mRNA的表达有关。

1 Morello JR，Vuorela S，MP.Antioxidant activity of olive pulp and olive oil phenolic compunds of the arbequina cultivar.J Agric Food Chem，2005，53:2002-2008.

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Effects of OLE on Carrageenan-induced Acute Inflammation and Hyperalgesia in Rats

GENG Cheng-yan1，GONG De-zheng2，JIANG Li-ping1，CAO Jun1，Yoshimura Hiroyuki2，ZHONG Lai-fu1*1China-Japanese Joint Institute for Medical and Pharmaceutical Science，Dalian Medical University.No.9，West Segment of South Lvshun Road，Dalian 116044，China;2Eisai Food＆Chemical Co.，Ltd，Nihonbashi，chuo-ku，Tokyo 103-0027，Japan

The aim of this study was to assess the inhibitory role of olive leaves extract(OLE)on carrageenan-induced swelling and hyperalgesia of rat paw.Paw inflammation was assessed by the increase in paw volume and hyperalgesia.The levels of the tumor necrosis factor alpha(TNF-α)，interleukin 1β(IL-1β)and interleukin 10(IL-10)mRNA in the tissue of right paw were estimated by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).The results showed that the paw pressure thresholds of rats orally administered OLE significantly increased the degree swelling of right hind paw showed a statistically significant reduction，compared with rats in model control.OLE decreased expression of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α.mRNA The results of the study suggest that OLE could have anti-inflammatory and anti-hyperalgesic effects and the mechanisms of these effects may be involved in inhibition of TNF-α and IL-1β mRNA expression.

Olive leaves extract(OLE);hyperalgesia;swelling;carrageenan;inflammation;rat

1001-6880(2011)05-0931-04

2010-09-02 接受日期:2011-04-14

*通讯作者 Tel:86-411-86110286;E-mail:zhong@dlmedu.edu.cn

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