眩灯蛾白僵菌菌株 (两株)的分离、鉴定及其对棉蚜致病力试验

孙佰平，徐 强，赵思峰，王佩玲

(1．新疆兵团化工绿色过程重点实验室，新疆石河子832003;2．新疆鄯善县农业技术推广中心，新疆鄯善838200;3．石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室，新疆石河子832003)

新疆是我国最适宜棉区和最大的优质商品棉生产基地，每年棉花种植面积稳定在140万km2以上，占新疆总耕地面积的1/3(刘晏良，2006)。在宜棉区，棉花面积占耕地的比例高达70%～80% (龚明福等，2007)。棉蚜 Aphis gossypii(Glover)是新疆棉区最重要的害虫之一，其发生范围遍布南、北疆各棉区 (芦屹等，2009)，除了直接吸食植物汁液为害外，还分泌大量蜜露粘附在棉花纤维上从而降低纤维品质。长期以来，对棉蚜的防治一直以化学防治为主，大量的、不合理的使用化学农药，导致其抗性发展速度快，抗性程度高，抗性背景复杂等 (陆宴辉等，2004)。因此，寻找安全的替代防治措施显得尤为迫切。由于昆虫病原微生物具有选择性强、防效高、生产成本低、不污染环境、对人畜无害等特点，越来越多的病原微生物被研究开发并用于害虫防治。白僵菌是世界各国研究应用较多的一类昆虫病原真菌，可侵染15目149科700多种昆虫 (Feng et al.，1994)。自冯明光1990年首次发现其具有杀灭蚜虫的特性以来，白僵菌防治刺吸式口器害虫的研究不断增多，已有大量关于采用白僵菌防治桃蚜、温室蚜虫的报道 (Feng et al.，1990;Zhang et al.，2005)。本文对从眩灯蛾Lacydes spectabilisc(Tauscher)自然死亡幼虫体上分离获得的白僵菌进行了鉴定，并在室内测定了其对棉蚜的致病力，用模型拟合了2个菌株的半致死时间和半致死浓度，从而为进一步研究和利用白僵菌防治棉蚜奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离、纯化

菌种采集自在新疆古尔班通古特沙漠南缘荒漠植物梭梭Haloxylon ammodendron上取食的眩灯蛾Lacydes spectabilisc(Tauscher)幼虫僵虫，采集时间为2007年7月15日，共采集到5头僵死幼虫。

1.2 所用培养基

PDA培养基:马铃薯200 g;葡萄糖20 g;琼脂15～20 g;蒸馏水1000 mL。

WA培养基:琼脂15～20 g;1000 mL。

察氏培养液:硝酸钠3.00 g;磷酸氢二钾1.00 g;MgSO4·7H2O 0.50 g;氯化钾0.50 g;硫酸亚铁0.01 g;蔗糖30.00 g;蒸馏水1000 mL。

1.3 供试棉蚜及棉花品种

在12 cm×12 cm×10 cm的发芽盒中依次垫上两层棉纱和一层滤纸，棉花叶片基部用无菌水浸润过的脱脂棉包裹，叶面朝下放在滤纸上，再从未施用农药的棉田中采集处于生殖盛期的棉蚜无翅成虫5头一组挑于上述叶片上，在20℃繁殖48 h后取出，每片叶上可产若蚜30～50头，在完成最后一次蜕皮后1～2 d内的成蚜作为供试虫体(袁盛勇等，2010)。棉花品种为新陆早13号，购买于石河子市种子市场。

1.4 菌株的分离纯化

采用组织分离法进行分离 (陈立杰等，2008)，用灭菌接种针从僵死虫体上挑取少许菌丝及孢子粉，接种于PDA培养基中，置于28℃培养箱中恒温培养，48 h后用打孔器打出0.7 cm的菌块接种于WA培养基上进行单菌丝分离纯化，挑取单根菌丝接种于另一PDA培养基上28℃培养48 h，然后转入试管中备用。共获得2株菌株，分别命名为CXJ－1和CXJ－2。

1.5 菌株的鉴定

1.5.1 菌株形态学鉴定

将保存的菌株接种于PDA平板上后置于保湿温箱 (温度25℃，相对湿度95%)中培养2周，用6.5 g/L且含有0.1%吐温－80的NaCl溶液冲洗平板表面，将菌丝和孢子液转移至150 mL三角瓶中，加入少量灭菌的玻璃珠，于4℃ 100 r/min振荡培养过夜，用四层灭菌纱布过滤，将滤液转移至灭菌的离心管中在4℃ 4000 r/min离心6 min，之后用无菌水洗涤3～4次后悬浮于6.5g/L且含有0.1%吐温－80的NaCl溶液中，配成孢子悬浮液，用接种环分别沾取菌株孢子悬浮液接种于PDA平板上，接种后置于28℃恒温箱中培养观察 (路国兵等，2007)，8 d后记录并观察菌落颜色变化和分生孢子的形态特征 (米红霞等，2010)。

1.5.2 分离菌株分子鉴定

挑选CXJ－1和CXJ－2两个菌株进行培养和DNA提取。菌株的培养和基因组DNA的提取主要参考方卫国 (2002)的方法进行。采用真菌通用引物 ITS1(3'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－5')和ITS4(3'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－5')扩增菌株的ITS和5.8SrDNA，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR反应体系:基因组DNA 2μL、10×PCR buffer 5μL、10mmol/L dNTP1μL、25mmol/L MgCl23μL、25μmol/L ITS1 1μL、25μmol/L ITS4 1μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，加入双蒸水至终体积为50μL。PCR反应条件是94℃ 5min预变性;94℃ 30s;55℃ 30s;72℃ 40s，进行 30循环后72℃延伸8min。反应完成后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。将PCR反应产物进行进一步纯化后委托生工生物工程 (上海)有限公司进行测序。将测序结果与已报道的Beauveria bassiana的5.8SrDNA以及能够导致昆虫死亡的另外3种真菌的18SrDNA用DNAMAN软件进行比对并构建系统树，应用自展法 (bootstrap)检验系统树，自展数据集为1000次。

1.6 两菌株对棉蚜侵染能力的测定

1.6.1 孢子悬浮液的制备

从在PDA平板上培养48 h的菌落上用灭菌的打孔器分别打取一块菌饼，接入装有300 mL察氏培养液的500 mL三角锥瓶中，28℃ 200 rpm摇床上摇床培养4 d。将培养好后的菌液用四层灭菌的纱布过滤，丢弃菌丝，用含有0.5%吐温－80的无菌水将孢子浓度分别稀释成4.75×109个/mL、4.75×108个/mL、4.75×107个/mL、4.75×106个/mL和4.75×105个/mL的悬浮液。

1.6.2 对棉蚜侵染能力的测定

试验采用试虫浸渍法 (陈立杰等，2008)。在50 mL烧杯中分别加入已配制的5个浓度的菌悬液20 mL，将试虫用毛笔挑入细孔纱网中，在孢子悬浮液中浸3～5 s后取出，转移至发芽盒内的新鲜棉花叶片上，每盒蚜虫40头，5次重复，并用0.5%吐温－80的无菌水作为空白对照，棉花叶片基部包裹浸润过无菌水的脱脂棉，每2d换一次新鲜叶片，25℃室内放置。每天观察记录各处理试虫死亡情况，昆虫针挑拨不动者即为死亡，将数据进行统计学分析，以不同浓度菌液对棉蚜的杀伤作用以毒力回归方程、致死中浓度 (LD50)和致死中时间 (LT50)为评价依据。

1.6.3 数据统计与分析

根据所观察实验结果数据计算接种后棉蚜的死亡率和侵染率 (Ballard EM et al.，1984;Khalil SK et al.，1985)，并以Abbott公式进行校正 (赵文琴等，2001):

以时间 (d)或菌液浓度 (个/mL)的对数值为X，校正死亡率的几率值为Y，采用几率值分析法，通过SPSS 18.0软件进行线性回归分析 (黄剑等，2004)，建立致病力回归方程，从而估计剂量效应LD50、LT50和相关系数 R2等参数 (袁胜勇等，2010)，并对两菌株进行毒力比较分析。

2 结果与分析

2.1 菌株形态学鉴定结果

观察所挑选的两个菌株在PDA平板上的菌落形态 (图1)产孢细胞和分生孢子，其特征为:CXJ－1菌株菌落色泽白色，基质色泽黄色，CXJ－2菌株菌落色泽白色，基质色泽淡黄色;无孢梗束，无明显气味，菌丝光滑;两个菌株的产孢细胞均呈烧瓶形或球形，簇生于菌丝或孢囊梗上;分生孢子球形或是近似球形、单孢、无色透明且光滑。从菌落形态及产孢细胞和分生孢子的形态特征初步将其鉴定为白僵菌属。

图1 两株白僵菌在PDA培养基上的菌落形态Fig 1 Colonialm orphology of two Beauveria bassiana strains on PDA media

2.2 18Sr DNA序列测定结果及同源性分析

测序结果为CXJ－和CXJ－2目标片段长度分别为500 bp、506 bp。将两个菌株测序结果与Gen-Bank数据库中的序列进行同源性比较，发现菌株与白僵菌属自然聚类，最相近的种的同源性达到100%。从同源性最高的序列中挑选出4个菌株序列和其他4个昆虫致病菌属真菌构建系统发育树，结果表明，CXJ－1和CXJ－2分别与B.bassiana isolate KTU －65(FJ792827)、B.bassiana isolate KTU－66(FJ792828)和B.bassiana isolate G66(GU566276)亲缘关系最近 (图2)，因此将两个菌株鉴定为球孢白僵菌B.bassiana。

图2 菌株CXJ－1和CXJ－2的系统发育树状图Fig.2 Phylogenetic tree based on alignment of strain CXJ－1 and CXJ－2 and other 4 fungi species including ITSI，5.8Sand ITS2 sequencing data

2.3 两菌株对棉蚜侵染能力的测定

在25℃条件下，两株球孢白僵菌CXJ－1和CXJ－2对棉蚜均具有有较强的致病力 (图3)，蚜虫死亡率随孢子悬浮液浓度提高和处理后时间延长而增加 (图4)。浓度为4.75×106个/mL～4.75×109个/mL孢子时两个菌株接种蚜虫后2d蚜虫就开始死亡，但校正死亡率较低。当5个处理浓度6d时累积校正死亡率达到较理想的效果，4.75×105个/mL和4.75×106个/mL浓度死亡率较低，其中4.75×105个/mL浓度最低，两个菌株的死亡率分别为37.20%和29.32%，浓度为4.75×109个/mL孢子时，两个菌株累计校正死亡率最高，CXJ－1和CXJ－2分别达到92.12%、90.88%。随着时间推移，两个菌株的致死中浓度LC50逐渐减小，4～7d菌株CXJ－1的LC50依次为5.31×108个/mL、1.50×107个/mL、2.03×106个/mL和 4.37×105个/mL，菌株 CXJ－2的 LC50依次为9.14×108个/mL、3.00×107个/mL、4.84 ×106个/mL 和1.08×106个/mL(表1)。随着孢子浓度增大，棉蚜LT50逐渐缩短，菌株CXJ－1 5个不同浓度孢子悬浮液的 LT50依次分别为 7.15、5.38、4.75、3.80和3.54d，菌株CXJ－2 5个不同浓度孢子悬浮液的 LT50依次分别为8.16、5.75、4.91、4.09和3.59d(表2)。菌株CXJ－1的LC50和LT50均比菌株CXJ－2的值小，说明棉蚜对菌株CXJ－1更敏感，菌株CXJ－1对棉蚜有更强的的致病力。

图3 两株白僵菌对棉蚜致病性效果Fig.3 The effect of two strains against Aphis gossypii

图4 菌株CXJ－1和CXJ－2两菌株五个不同孢子悬浮液和对照组 (CK)对棉蚜的室内致病力实验结果Fig.4 ThevirulenceoffivedifferentconcentrationsofstrainCXJ－1，CXJ－2andCKagainstAphisgossypiiwastested byusinginsectdipbioassayinlaboratory．

表1 两株球孢白僵菌分生孢子液对新疆棉蚜幼虫的致病力与致死中浓度Table1 RegressionandmedianlethalconcentrationofthetwostrainstoAphisgossypii

表2 两株球孢白僵菌分生孢子液对新疆棉蚜幼虫的致病力与致死中时间Table2 RegressionandmedianlethaltimeofthetwostrainstoAphisgossypii

3 结论与讨论

白僵菌是真菌杀虫应用最多的一个类群，在持续长久控制害虫和保持生态平衡方面具有十分重要的作用，是一类具有实际应用价值的杀虫微生物。本研究从在古尔班通古特沙漠南缘荒漠植物梭梭上取食的眩灯蛾死亡幼虫上分离获得了2株致病菌，对其进行形态学和分子生物学鉴定，将其鉴定为球孢白僵菌。

棉蚜是新疆棉花的重要害虫，目前对其防治仍以传统的化学防治为主，不仅产生农药残留，污染环境，而且易杀伤天敌，破坏生态平衡。本研究用鉴定的球孢白僵菌感染棉蚜，结果表明，球孢白僵菌对棉蚜具有很高的杀虫活性，其中菌株CXJ－1比菌株CXJ－2对棉蚜致病力更有优势，且稳定性较好。利用球孢白僵菌防治棉蚜研究的相关文献在国内外还鲜有报道，本研究所分离球孢白僵菌对棉蚜表现出较强的致病力，具有较好的应用潜力，但田间环境比室内环境复杂得多，要进一步对其推广应用，还有待于进一步深入研究。

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