球孢白僵菌对象虫金小蜂安全性评价和亚致死效应研究

喻 芳,张 越,杨佳鹏,杨 洪*,张晓敏,胡大鸣,王 燕

(1. 贵州大学昆虫研究所,贵州山地农业病虫害重点实验室,贵阳 550025;2. 贵州中烟工业有限责任公司,贵阳 550025)

烟草甲Lasiodermaserricorne(Fabricius)隶属鞘翅目Coleoptera窃蠢科Anobiidae,是世界性仓储害虫,分布较广,其幼虫取食储藏期烟叶,不仅会导致烟叶数量损失,还会有虫尸及虫粪的残留导致卷烟变质(李朝辉等,2021)。多年来我国防治烟草甲基本以熏蒸为主,但长期使用导致烟草甲对化学熏蒸药剂产生抗药性、防治效果逐渐减弱(张晓敏等,2015)。面对化学农药使用的弊端,研究者开始利用病原真菌和天敌昆虫对贮烟害虫进行生物防治。

象虫金小蜂Anisopteromaluscalandrae(Howard),属膜翅目金小蜂科(孙永超等,2007),是体外单寄生蜂,国内外研究表明象虫金小蜂对烟草甲的防控潜力前景可观(Ghimireetal.,2007;郭军等,2018;郭建华等,2021)。此外,国内外研究者还利用微生物对烟草甲的防治进行了研究,如利用绿僵菌Metarhizium、白僵菌Beauveria、苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis等防治烟草甲(高家合等,2005;王慧等,2013;Saeedetal.,2017;田野等,2021)。球孢白僵菌Beauveriabassiana孢子吸附在害虫体表后萌发菌丝穿透昆虫体壁在寄主体内繁殖,从而对害虫造成机械损伤,同时释放毒素进行侵染致使寄主死亡(Fengetal.,1994;曹庆杰等,2015,Duanetal.,2017;阙生全等,2019),具有对环境无污染,侵染范围广、致病性强、适应性强等特点。已有研究报道球孢白僵菌对烟草甲具有良好的防治效果,如朱元等人(2009)研究发现在25℃温度条件下,球孢白僵菌Bb050722菌株对烟草甲2龄幼虫的毒力较强;刘爱英等人(2009)利用白僵菌GUIFR-GL-5菌株防治烟草粉螟和烟草甲均有良好防效。

相比单一生物防治措施,多种天敌联合应用能提高其相互协同防治害虫的效果(胡中成等,2007;Ikegawaetal.,2015)。吴圣勇等人(2019)的研究表明昆虫病原真菌与捕食螨二者联合防治害虫具有潜在增效作用;杨芷等人(2020)证明球孢白僵菌BbOFDH1-5菌株与赤眼蜂Trichogramma协同防治亚洲玉米螟OstriniafurnacalisGuenée效果比单独使用赤眼蜂防治的效果更好;钱逸彬等人(2021)研究表明利用烟蚜茧蜂Aphidiusgifuensis携带球孢白僵菌Bb81菌株对桃蚜防效高于单独使用烟蚜茧蜂的防效。因此,在生物防治中,昆虫病原真菌和天敌昆虫对害虫均具有较好的防控潜力,但采用二者同时防治仓储害虫时,为有效进行仓储害虫生物防治,需明确昆虫病原真菌对天敌昆虫的安全性。为此,本研究开展了球孢白僵菌对烟草甲与象虫金小蜂的致病性研究以及亚致死浓度球孢白僵菌胁迫对象虫金小蜂F1代生长发育和繁殖的影响,为可持续防控烟仓害虫提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试虫源:象虫金小蜂、烟草甲于2016年10月采自贵州中烟公司烟仓(贵阳),在贵州大学昆虫研究所室内饲养至今,象虫金小蜂用烟草甲幼虫饲养,烟草甲用人工饲料(玉米渣∶酵母粉∶烟叶粉=15∶10∶7.5)饲养。饲养条件:温度: 25±1℃、RH 70%±5%、光周期16 L∶8 D。

供试菌株:贵州大学生命科学学院邹晓教授赠送的GZUIFRAS1号球孢白僵菌。

1.2 试验方法

1.2.1球孢白僵菌对烟草甲致病力的测定

参照邓竣丹等人(2021)研究方法,将携带球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株孢子的培养基用20 mL无菌水和10 μL 0.05%吐温-80混合摇匀,使菌株孢子充分脱落于水中,用纱网滤去残渣,并用血球计数板在生物显微镜下计数后,再进行稀释定容,配制浓度分别为1×106、1×107、1×108和1×109孢子/mL的球孢白僵菌悬浮液备用。然后采用浸渍法(邓竣丹等,2021)处理,即将烟草甲高龄幼虫和初羽化成虫分别在不同浓度悬浮液中浸沾10 s,并迅速取出,置于放有滤纸的培养皿中,以饲料饲喂,接菌后24 h内用湿棉花团保持RH 85%以上;以0.05%吐温-80的无菌水处理作对照。将处理的幼虫和成虫分别置于25±1℃人工气候箱中。每个处理浸渍50头烟草甲幼虫和成虫,且每组重复3次。逐日记录8 d内烟草甲成虫、幼虫死亡数,计算死亡率、校正死亡率、致死中时LT50和致死中浓度LC50;之后将死亡的烟草甲幼虫和成虫置于25℃下RH 85%以上的培养皿中3 d后,逐日镜检死亡幼虫受感染情况,计算侵染率。

1.2.2球孢白僵菌对象虫金小蜂致病力的测定

方法同1.2.1,选取羽化第2天的象虫金小蜂成虫放入配制好的不同浓度球孢白僵菌悬浮液中浸渍10 s取出放于垫有滤纸的培养皿中,用10%蜂蜜水喂养,接菌后24 h内用湿棉花团保持RH 85%以上,以含有0.05%吐温-80的无菌水作对照。每个处理30头象虫金小蜂成虫,每组重复3次,每24 h记录象虫金小蜂死亡情况,计算死亡率、校正死亡率、致死中时LT50和致死中浓度LC50。之后将死亡的象虫金小蜂置于25℃下RH85%以上的培养皿中3 d,逐日镜检死亡受感染情况,计算侵染率。

1.2.3亚致死浓度球孢白僵菌对象虫金小蜂F0代存活率的影响

参照杨洪等(2013)研究方法略有改进。为了评估已感染球孢白僵菌的象虫金小蜂成虫产卵量的影响,通过球孢白僵菌对象虫金小蜂的毒力方程计算出其亚致死浓度。先将携带白僵菌孢子的培养基至于锥形瓶中,加入20 mL无菌水和 10 μL 0.05%吐温-80混合摇匀使其基本脱落后,用纱网滤去残渣,在生物显微镜下计数后,再进行稀释定容,配制成1×109孢子/mL的母液。然后取部分母液用去离子水等比稀释菌株为LC10和LC25的2个浓度梯度。再分别用亚致死浓度LC10和LC25的GZUIFRAS1号菌株孢子悬浮液浸渍羽化第2天的象虫金小蜂成虫,每组15对象虫金小蜂,以未接菌的象虫金小蜂成虫作对照。将处理后的象虫金小蜂置于大培养皿中,观察8 d,计算其存活率。

1.2.4亚致死浓度球孢白僵菌对象虫金小蜂F1代生长发育和繁殖力的影响

以LC10和LC25浓度的菌株孢子悬浮液处理象虫金小蜂成虫(已交配过的雌蜂)后,将其分别置于装有150粒包含烟草甲幼虫的茧的大培养皿中,寄生8 h后,分别取出50粒卵(连带寄主),将其单个放入小培养皿中置于人工气候箱内饲养。以未接菌的象虫金小蜂成虫作对照。每处理取50粒卵单头饲养,每24 h观察一次,并记录F1代幼虫发育历期、存活率和雌性比。

将每组处理正常羽化出的F1代雌雄蜂进行配对,置于培养皿中单对饲养,每对蜂每2 d接入30粒/皿内含有烟草甲老熟幼虫茧供其产卵寄生。以未接菌的F1代象虫金小蜂成虫作对照。从接蜂之日开始,每处理分别共记录50头象虫金小蜂雌蜂产卵量,直至象虫金小蜂死亡。

1.2.5象虫金小蜂室内种群生殖力生命表的构建

参照杨洪等(2013)方法组建象虫金小蜂的种群生命表。根据昆虫特征年龄(x)、特征存活率(lx)和产卵量(mx)等参数,以d(x)为单位间隔,组建亚致死浓度球孢白僵菌对象虫金小蜂F1代的种群生命表,生命表参数计算公式如下:

净增殖率R0=∑lxmx;

平均世代周期T=∑xlxmx/R0;

内禀增长率rm=ln(R0)/T;

周限增长率λ=erm;

种群倍增时间Dt=ln(2)/rm。

其中x为以2 d为单位的时间间隔;lx为个体在x期间的存活率;mx为在x期间内单雌产卵量。

1.3 数据分析

数据采用Excel 2016整理,生存曲线图采用Graphpad Prism 8软件绘制,并利用Log-rank test进行组间差异显著性检验。采用DPS数据处理系统软件进行毒力测定,并计算致死中时LT50和致死中浓度LC50,同时,文中产卵量、产卵前期、寿命、存活率、侵染率等指标采用单因素方差分析后,再利用LSD法多重比较。计算方式如下:

死亡率(%)=死亡虫数/供试虫数×100

存活率(%)=1-死亡率=存活虫数/供试虫数×100

校正死亡率(%)=(处理组的死亡率-对照组的死亡率)/(1-对照组的死亡率)×100

侵染率(%)=侵染死亡虫数/供试虫数×100

雌性比=雌蜂数/总出蜂数

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌对烟草甲致病力的测定

致病力测定结果表明,球孢白僵菌不同浓度对烟草甲幼虫致病力均较高(表1),球孢白僵菌浓度为1×109孢子/mL和1×108孢子/mL对烟草甲幼虫的致死时间最短,分别为3.35 d和3.33 d,校正死亡率均在90%以上,二者之间差异不显著(P>0.05)。浓度1×107孢子/mL对烟草甲校正死亡率为89.74%,LT50为4.58 d。浓度1×106孢子/mL对烟草甲校正死亡率为63%,LT50为7.38 d,与其他3个浓度均表现差异性显著(P<0.05)。因此,在同等条件下,1×106孢子/mL浓度以上的球孢白僵菌对烟草甲幼虫均呈现高毒力,计算其3 d的致死中浓度为3.556×106孢子/mL。

表1 不同浓度球孢白僵菌对烟草甲幼虫的致病力

球孢白僵菌不同浓度孢子对烟草甲成虫均具有较高致病力(表2),其中,球孢白僵菌浓度为1×109孢子/mL和1×108孢子/mL对烟草甲成虫的校正死亡率为100.00%和99.26%,致病时间最快,均约为2 d,二者之间差异不显著(P>0.05)。浓度为1×107孢子/mL时,对烟草甲成虫的校正死亡率为97.04%,LT50为3.33 d。浓度为1×106孢子/mL时,对烟草甲成虫的校正死亡率为95.56%,LT50为3.96 d,与其他3个浓度均表现差异性显著(P<0.05),计算其3 d的致死中浓度为2.629×106孢子/mL。

表2 不同浓度球孢白僵菌对烟草甲成虫的致病力

不同浓度孢白僵菌对烟草甲幼虫和成虫的生存曲线影响较大(图1),与对照组相比,不同浓度球孢白僵菌对烟草甲幼虫和成虫致病力较高,且其死亡率和死亡速率均呈正相关,且球孢白僵菌浓度从1×106孢子/mL至1×109孢子/mL均有显著性差异(P<0.0001),且每个浓度的球孢白僵菌对烟草甲幼虫和成虫的存活率均低于10%。从以下两个图对比可看出,球孢白僵菌对烟草甲成虫的致死率高。

图1 不同浓度球孢白僵菌侵染烟草甲幼虫和成虫后的生存曲线图

2.2 球孢白僵菌对象虫金小蜂成虫致病力的测定

球孢白僵菌对象虫金小蜂成虫的致病力影响(表3),1×107孢子/mL以上的球孢白僵菌浓度对象虫金小蜂成虫均具有较高致病力,死亡率在67.09%～100%之间。其中,球孢白僵菌浓度为1×109孢子/mL和1×108孢子/mL时对象虫金小蜂成虫的校正死亡率为100.00%和98.73%,LT50为3.15 d和2.78 d,二者之间差异不显著(P>0.05)。浓度10×106孢子/mL对象虫金小蜂成虫校正死亡率为67.90%,LT50为5.21 d。浓度1×106孢子/mL对象虫金小蜂成虫校正死亡率为35.45%,LT50为8.33 d,与其他3个浓度均表现差异性显著(P<0.05),计算其3 d的致死中浓度为2.725×106孢子/mL。

表3 不同浓度球孢白僵菌对象虫金小蜂成虫的致病力

不同浓度球孢白僵菌对象虫金小蜂成虫致病力较高,且对象虫金小蜂成虫的死亡率和死亡速率与对照组对比,均呈正相关(图2)。其中,球孢白僵菌浓度为1×106孢子/mL至浓度1×109孢子/mL与对照组相比均有极显著性差异(P<0.0001),当浓度为1×108孢子/mL和1×109孢子/mL时,象虫金小蜂成虫的存活率均低于10%。

图2 不同浓度球孢白僵菌侵染象虫金小蜂成虫后的生存曲线

2.3 球孢白僵菌对象虫金小蜂成虫的毒力测定

采用浸渍法测定了球孢白僵菌对象虫金小蜂的致病力(表4)。球孢白僵菌对象虫金小蜂成虫的毒力回归方程为y=1.157x+3.340,斜率为1.157,相关系数为0.985。亚致死浓度LC10和LC25分别为2.125×105孢子/mL和7.114×105孢子/mL。

表4 球孢白僵菌对象虫金小蜂成虫的毒力

2.4 亚致死浓度球孢白僵菌对F0代象虫金小蜂存活率的影响

亚致死浓度球孢白僵菌处理对F0代象虫金小蜂生存曲线有较大影响(图3),经LC10和LC25处理后,象虫金小蜂的存活率均低于对照。由此可看出,球孢白僵菌对象虫金小蜂具有很强的致病力。

图3 亚致死浓度球孢白僵菌胁迫对F0代象虫金小蜂存活率的影响

2.5 亚致死浓度球孢白僵菌对F1代象虫金小蜂生长发育的影响

球孢白僵菌亚致死浓度处理对象虫金小蜂F1代发育历期有一定影响(表5),与对照组相比,LC10处理和LC25处理后的象虫金小蜂F1代卵期略缩短,总历期分别延长0.73 d和0.75 d,均表现显著差异(P<0.05)。象虫金小蜂幼虫期和蛹期与对照相比略延长,差异不显著(P>0.05)。其中,LC25处理的象虫金小蜂卵期和成虫前期比LC10处理的长,分别为0.13 d和0.02 d,但均无显著差异(P>0.05)。说明该菌株对象虫金小蜂的发育速率有一定的抑制作用。

表5 亚致死浓度球孢白僵菌胁迫对 F1 代象虫金小蜂生长发育的影响

2.6 亚致死浓度球孢白僵菌对F1代象虫金小蜂繁殖力及寿命的影响

球孢白僵菌胁迫处理对F1代象虫金小蜂代繁殖力及成虫寿命的影响较大,受菌株处理前后象虫金小蜂产卵期、产卵量、雌性比及成虫寿命都发生了一定的变化(表6)。对照组象虫金小蜂产卵期和产卵量分别为20.14 d和114.25粒,与对照相比,经LC10和LC25处理后,雌成虫的产卵期缩短(分别为19.33 d和16.5 d),产卵量降低(分别为92.42粒和74.86粒),这表明球孢白僵菌对对雌成虫产卵量有很强的抑制作用。但三组处理之间雌性比表现无显著性差异(P>0.05)。与对照相比,在LC10处理后,成虫寿命差异不显著(P>0.05);LC25处理后,成虫寿命差异显著(P<0.05)。综上,随着球孢白僵菌浓度升高,对象虫金小蜂F1代成虫繁殖力及其寿命影响越大,且能在一定程度抑制象虫金小蜂的繁殖力。

表6 亚致死浓度球孢白僵菌胁迫对F1代象虫金小蜂成虫繁殖力和寿命的影响

球孢白僵菌处理对象虫金小蜂F1代的平均日产卵量有一定影响,对照组与处理组的平均日产卵量曲线均呈多峰型,对照组产卵最高峰期在成虫羽化后12 d (图4),LC10和LC25处理产卵最高峰期分别是28 d和20 d;处理组的平均日产卵量曲线基本处于对照组的下方,说明,该菌株对象虫金小蜂的产卵量具有一定的抑制作用。

图4 球孢白僵菌胁迫对F1代象虫金小蜂平均日产卵量的影响

2.7 亚致死浓度球孢白僵菌对F1代象虫金小蜂存活率的影响

亚致死浓度球孢白僵菌处理对F1代象虫金小蜂存活曲线,处理组的存活率明显低于对照。第1～2 d,处理组的存活率基本与对照相同,之后开始下降;处理组的存活时间也明显短于对照(图5)。

图5 亚致死浓度球孢白僵菌胁迫对F1代象虫金小蜂存活率的影响

2.8 亚致死浓度球孢白僵菌对F1代象虫金小蜂生命表参数的影响

根据象虫金小蜂F1代各发育阶段的存活率和成虫的繁殖力,组建了不同亚致死球孢白僵菌浓度处理后象虫金小蜂F1代的生殖力生命表(表7～9),并得出不同处理后的种群生命表参数(表10)。从反映种群动态较为敏感的参数rm值来看,经亚致死浓度球孢白僵菌LC10和LC25胁迫处理后,与对照相比,随浓度增加,象虫金小蜂的净增殖率R0由35.5200下降至14.1552,平均世代周期T相差不大,种群倍增时间Dt也随之增加,由7.1311 d升至9.1808 d。LC10处理下的平均世代周期T、种群倍增时间Dt、种群内禀增长率rm和周限增长率λ均与对照组相差不大。以上种群参数表明,随着球孢白僵菌处理的浓度越高,象虫金小蜂种群生殖力呈下降趋势,一定程度上抑制了种群增长的速率,但LC10处理后的结果基本与对照组相当,对象虫金小蜂种群增长速率影响较小。

表7 对照处理组象虫金小蜂实验种群生殖力生命表

表8 LC10球孢白僵菌胁迫下象虫金小蜂实验种群生殖力生命表

表9 LC25球孢白僵菌胁迫象虫金小蜂实验种群生殖力生命表

表10 亚致死浓度球孢白僵菌胁迫对F1代象虫金小蜂的生命表参数的影响

3 结论与讨论

球孢白僵菌对大多数害虫都有较强致病力,它是一种潜在的环境友好型生物杀虫剂(Duanetal.,2017)。在防治害虫时采取以球孢白僵菌与其他药剂或天敌联合防治害虫能有效提高防效,目前多数研究是以球孢白僵菌和各药剂联合防治害虫(陈翰秋,2018;曹伟平等,2018;关朝阳等,2022),也有研究以球孢白僵菌与天敌昆虫或螨联合防治害虫(刘洪剑等,2007;邓竣丹等,2021;钱逸彬,2021)。

本研究表明,球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株对烟草甲和象虫金小蜂均表现较强致病力,且死亡率和死亡速度随着浓度增加而显著增加(P<0.05),当菌株孢子浓度为1×108孢子/mL和1×109孢子/mL处理时,烟草甲和象虫金小蜂存活率均低于10%,此研究结果与刘玉军等(2008)研究的高毒力球孢白僵菌(Bb202菌株)对栎旋木柄天牛Aphrodisiumsauteri的致死效果一致。同时,在本研究中发现球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株对象虫金小蜂也有较强致病力,此结果与邓竣丹等(2021)研究利用天敌昆虫花绒寄甲Dastarcushelopho-roides与球孢白僵菌(Bb3275菌株、Bb202菌株)联合防治具有相容性不同,且与钱逸彬(2021)研究烟蚜茧蜂的携带球孢白僵菌Bb81防治烟蚜具有协同增效的结果也不同。推测一可能是供试球孢白僵菌菌株不同造成;二可能是试验方法不同造成。本研究采取浸渍法,此法会让象虫金小蜂全身都沾到菌株孢子,孢子通过象虫金小蜂体壁进入,并繁殖,使其致病;而采取涂膜携带菌株孢子的方法基本只会沾到具有一定绒毛的足部和触角,从而使其不容易被感染。因此,象虫金小蜂与球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株不能兼容的结果可能受多方面因素影响,这对后续深入研究二者混用具有重要意义。

为进一步探讨球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株对象虫金小蜂的安全性,本研究采用球孢白僵菌亚致死浓度LC10和LC25胁迫处理象虫金小蜂成虫,发现其F0代和F1代的存活率均显著低于对照(P<0.05),且F1代雌成虫产卵量和成虫寿命与对照相比均降低,发育历期比对照均有延长,象虫金小蜂内禀增长率rm、净增值率R0和周限增长率λ均随着浓度增加而减小,而种群倍增时间Dt延长。这说明球孢白僵菌亚致死浓度能够抑制象虫金小蜂种群的增长速率,这与张兴瑞研究表明的球孢白僵菌对剑毛帕厉螨具有的间接影响结果相似(张兴瑞,2019)。

通过本研究结果可看出,球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株对烟草甲和象虫金小蜂的致病力较强,并会加快其死亡速率。球孢白僵菌亚致死浓度LC10和LC25处理对象虫金小蜂F1代产卵期、产卵量和成虫寿命均有不同程度的影响,且球孢白僵菌可抑制象虫金小蜂种群繁殖力的增长,因此,采用白僵菌和象虫金小蜂防治烟草甲时,可考虑错峰防治或采用不同释放方式进行防治。