大鼠活体心肌缺血再灌注损伤模型的建立与综合评估*

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(广东省人民医院，广东省医学科学院1急危重症医学部，2广东省心血管病研究所心内科, 3医学研究中心，4图书馆， 广东 广州 510080)

·实验技术·

大鼠活体心肌缺血再灌注损伤模型的建立与综合评估*

邓宇珺1，符永恒3，谭宁2△，曾红科1，单志新3，林秋雄3，李晓红3，董小莉2，余细勇3，杨敏3，谭卫萍4，苏健3

(广东省人民医院，广东省医学科学院1急危重症医学部，2广东省心血管病研究所心内科,3医学研究中心，4图书馆，广东广州510080)

目的构建并评估大鼠活体心肌缺血再灌注损伤(I/R)的实验动物模型。方法将清洁级成年SD雄性大鼠72只，随机分为正常组、假结扎组和I/R模型组, 手术的两组全麻下开胸暴露心脏，假结扎组只过线不结扎，模型组使用“U形金属管”进行冠状动脉左前降支结扎，持续心电图监测，并于再灌注2 h与4 h后进行血浆生化﹑心肌组织学的检测。结果与正常组和假结扎组比较，I/R模型组心电图有明显ST-T改变和再灌注后病理性Q波，再灌注2 h和4 h时存在比较明显的ST-T改变；血标本检测示心肌型肌酸激酶同功酶(CK-MB)、心肌钙蛋白I(cTnI)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平显著升高(P<0.05或P<0.01)，T-SOD水平在2 h和4 h也应激性升高(P<0.05)；心肌组织病理学检测显示模型组左心室心肌损伤疤痕明显，且2 h模型组左室心肌存在间隔性梗死区域，4 h模型组心肌组织区域性梗死和梗死面积明显增加；TUNEL法与Bcl-2﹑Bax蛋白实验显示2 h和4 h心肌细胞凋亡数量明显增加；Bcl-2/Bax蛋白表达阳性细胞比值下降显著(P<0.01)。结论成功建立大鼠活体心肌I/R模型，模型大鼠的心电图、血清学、心梗面积﹑心肌细胞凋亡和心肌组织病理学等发生显著改变。

大鼠； 再灌注损伤； 细胞凋亡

随着老龄化人口的增多，临床上由于心肌缺血引起的一系列心血管病越来越常见，且治疗效果欠佳。心肌缺血及药物治疗后引起再灌注细胞损伤、细胞结构改变和受破坏的机制如何，尚需进一步研究。目前对心肌缺血的研究不断深入，基础研究包括细胞水平研究和动物实验研究。所以成功建立可靠的活体心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)的实验动物模型至关重要。本实验利用现有较为先进的仪器设备条件和改良方法建立活体I/R模型，并进行多指标检测与评估分析。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物与分组 清洁级成年健康的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，体重250-300 g，购于中山大学实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2008-0020。随机将大鼠分为正常组(N,n=12)、假结扎组(sham,n=12)和心肌缺血再灌注模型组(I/R组)，后者又分为：(1)心肌缺血35 min，再灌注2 h组(I/R 2 h,n=24)；(2)心肌缺血35 min，再灌注4 h组(I/R 4 h,n=24)。

1.2仪器与试剂 TKR-200C小动物呼吸机(江苏省特力麻醉呼吸设备公司)；Pclab-3084科研型生物医学信号采集处理系统(北京微信斯达科技发展有限责任公司)，测心电图；MiVnt图像分析软件系统(上海光学仪器厂)。(1)2%伊文氏蓝(Evans blue)； (2)1%氧化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。

1.3活体I/R模型的建立方法 参考文献[1，2]的方法进行改良，用自制“U型合金管”压管法：SD大鼠术前12 h禁食，可饮水；以盐酸氯胺酮(规格：100 mg/2 mL)4.5-7.5 mg/kg和地西泮(规格：10 mg/2 mL)3-4.5 mg/kg进行肌肉注射麻醉后，仰卧固定四肢与头部。记录Ⅱ导联心电图，颈部和胸部脱毛，消毒，剪皮，钝性分离并暴露气管，切开立即用24 G×0.75、0.7 mm×1.9 mm规格的静脉留置针前软管(1.5 mm×2.0 mm)行气管插管，连接小动物呼吸机(通气：95%O2和5%CO2混和气体，湿度中度，呼吸频率80次/min，呼吸比为1∶2.5,工作压力0.01 MPa)；然后，于3-4肋间切皮钝性分离开胸。拉钩拉开，破心包膜暴露心脏，在肺动脉圆锥左侧与左心耳交界下缘2-3 mm处，以6/0无创缝合针丝线，进针深度1.5-2 mm,宽2-3 mm,置“U形金属管”以压管法活结结扎左冠脉前降支(left anterior descending,LAD)，肉眼观心脏左室壁出现变暗变紫，且心电图呈示ST段明显抬高(>0.25 mV)为结扎成功。35 min后，松开活结复灌，可观察到缺血区心肌慢慢变红色，紫绀区变小；再灌注2 h与4 h，心电图ST段逐渐下降近一半(0.15 mV)左右。

1.4左心室心肌损伤区及梗死区面积的检测 缺血再灌注结束后，再结扎阻断LAD,先行腹腔静脉采血4 mL后，经静脉注射2% Evans blue 1.5 mL，待2-3 min大鼠嘴舌均呈蓝色后，取心脏，除去右心房右心室，留左心室即置于-20 ℃冰冻25 min；用刀片将左心室按2.0-2.5 mm厚度切成5片；立即转到预温37 ℃的1%TTC磷酸盐缓冲液中染色10-15 min。肉眼可观察到：梗死区心肌为白色，非缺血区为红色，而缺血损伤的心肌呈淡蓝色。然后，将切片置于10%中性甲醛液中固定24 h，用800万像素数码相机拍照。图片采用MiVnt图像分析软件系统进行分析，计算出每只实验大鼠的左心室总横截面面积，缺血危险面积和梗死区面积，求出缺血危险区面积/左心室总截面面积﹑梗死区面积/缺血危险区面积的百分比为心肌梗死区面积。

1.5心肌损伤标志物和氧化应激相关指标的检测 用分离的血浆进行心肌型肌酸激酶同功酶(MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)和心肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)免疫发光法检测(贝克曼全自动仪)；而且用化学法测试氧化应激相关的一氧化氮(nitric oxide, NO)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，以及总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性(购于南京建成生工所)。

1.6心肌细胞凋亡指数与Bcl-2﹑Bax蛋白的检测 先行心肌石蜡切片,心肌组织于4%甲醛(pH7.4)固定48 h(4 ℃)，然后置于75%乙醇中，再做常规石蜡包埋后，进行心肌横向切片(厚度3-4 μm)，烤干后置室温备用。(1)TUNEL法检测心肌细胞凋亡率：应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)标记心肌细胞凋亡细胞核。在酶的介导之下，使荧光素化的dUTP 标记于DNA断裂后的3'-OH末端，使过氧化物酶连接到DNA的断点，加入荧光显色剂和DAPI显色，在波长465-495nm时荧光显微镜下观测到心肌凋亡细胞的细胞核呈绿色；而同样背景在激发光波长为330-380nm下，所有心肌细胞核呈蓝色。各拍摄6个400倍放大视野，分别计算蓝色心肌细胞总数和绿色凋亡细胞总数，然后，计算出心肌细胞平均凋亡指数(apoptotic index, AI=凋亡细胞总数/心肌细胞总数×100)来表示缺血再灌注损伤细胞凋亡情况。(2) 免疫组化法检测心肌组织Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)﹑Bax(Bcl associate X protein)蛋白：用链霉素蛋白-过氧化物酶(streptavidin peroxidase, SP)免疫组化法，以Bcl-2与Bax单抗进行免疫组化染色，加DAB酶底物显色呈棕色为阳性反应；同时，用恶性淋巴瘤组织切片做SP免疫组化染色阳性对照，而以非免疫血清代替Bcl-2和Bax单抗做阴性对照。在光学显微镜下计算6个高倍视野(×400)中的Bcl-2与Bax阳性细胞数和所占总细胞数比例的均值，再求Bcl-2/Bax蛋白表达阳性细胞比值。

2统计学处理

结 果

1使用“U形金属管”成功建立了活体大鼠心肌缺血再灌注模型

“U形金属管”是利用锡铝合金剪切、卷曲制成，其“U”形利于结扎时活结的固定,见图1。

2心电图

同N组和sham组比较，I/R组心电图有明显的ST段改变，且复灌后2 h和4 h还存在比较明显的ST-T改变及抬高的较宽的病理性Q波，这是建立模型成功的标志，见图2。缺血35 min时心率增快，复灌后有心率失常且以短期性室性心动过速和室性早搏为主。

Figure 2. Comparison of electrocadiogram(ECG) in different groups. A：normal rat ECG before coronary artery ligation;B: ECG of sham group at 2 h; C: ECG of sham group at 4 h; D: ECG after ligation; E: ECG of I/R group 2 h after reperfusion; F：ECG of I/R group 4 h after reperfusion.

3左室心肌缺血区及梗死区面积结果

(1)HE染色显示：心肌组织损伤区有明显的炎症细胞浸润；心肌细胞变形，胞核体积变大。(2)TTC染色示：缺血复灌2 h时左室心肌组织出现了心肌梗死区和部分损伤区，4 h时梗死区因细胞线粒体内缺乏琥珀酸脱氢酶呈灰白色；sham组心肌组织没有缺血梗死而呈红色,见图3。2 h和4 h模型组同sham组比较，心肌梗死面积明显增加(P<0.01)，见表1。

Figure 3. Comparison of myocardial infarct size in sham, I/R 2 h and I/R 4 h groups. A: sham group:B: I/R 2 h group; C: I/R 4 h group.

表1 心肌梗死面积和细胞凋亡指标结果

4细胞凋亡率与Bcl-2﹑Bax蛋白的检测结果

(1)心肌切片TUNEL法细胞核荧光染色查示：心肌缺血再灌注后2 h、4 h心肌细胞凋亡数量增加明显，而假结扎组心肌细胞凋亡极少。(2)心肌组织免疫组化法检测胞浆Bcl-2和Bax蛋白染色提示：假手术组仅有极少数散状的Bcl-2与Bax蛋白阳性细胞，而缺血再灌注(2 h、4 h)组Bax蛋白明显增加，Bcl-2蛋白也略有增加。但同假手术组比较模型组Bcl-2/Bax比值下降显著(P<0.01)，见表 1。这进一步说明缺血再灌注损伤促进了心肌细胞凋亡。

5血浆CK-MB﹑cTnI和NO﹑MDA﹑T-SOD与GSH-Px检测结果

(1)心肌梗死标志物CK-MB﹑cTnI在2 h和4 h模型组中较sham组明显增加(P<0.01)。(2)血中氧化应激指标MDA和NO含量升高明显(P<0.01)，而T- SOD和GSH-Px的活性升高也明显(P<0.05),见表2。这些结果证明心肌损伤和梗死同时存在，自由基损伤作用与抗氧化机制已启动。

表2 血浆指标检测结果

讨 论

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia and reperfusion injure，MI/R) 是临床心绞痛、AMI早期再灌注、经皮穿刺冠状动脉腔内成形术及心脏移植术后等心功能不全和心律失常的主要病理基础[3]；也是近年来临床心血管病治疗中备受关注且较突出的问题[4]。心肌缺血再灌注损伤的临床表现是心肌收缩功能下降﹑冠脉功能障碍﹑微小血管受损，并发生心肌组织水肿﹑黏附因子增加和白细胞浸润，从而引起细胞凋亡与心肌梗死，最终导致心脏功能减弱。有研究报道，同MI/R相关的因素有自由基损伤作用﹑微血管损伤﹑钙超载﹑补体激活﹑中性粒细胞﹑内皮细胞功能失调﹑血小板﹑凋亡和心肌能量代谢障碍等[5，6]。

而建立I/R模型是进行缺血再灌注损伤及其心肌保护机制研究的重要手段。大鼠MI/R造模常用方法为推管法和结扎法，这2种方法存在操作困难和严重磨损心肌﹑造成过多出血等问题。我们在近十年成功结扎LAD构建动物急性心肌梗死模型操作技术的基础上[7]，利用自制的“U形金属管”(锡铝合金)进行压管法活结结扎LAD，成功制备活体MI/R实验模型。“U形金属管”的“U”形利于结扎时的活结固定。以前常用垫片行缺血再灌注实验时，因垫片软，细细的结扎线可能会划破垫片表面、陷入垫片，加上实验中动物血液沾染等问题，在松解活结时，可能出现松解障碍，影响再灌注的顺利开始；而“U形金属管”是金属制作，活结结扎在其表面，不会出现上述问题，松解活结时无障碍，保障再灌注的顺利开始；而且它耐高温、耐酒精消毒，利于实验的无菌实施。使用自制的“U形金属管”(锡铝合金)进行压管法活结结扎LAD，制备活体MI/R实验模型，成功率很高。我们并行多项目以先进仪器检测和综合分析，评估模型相关合理的科学证据，特别是心电图﹑心肌损伤标志物特异指标﹑左室心肌损伤区及梗死区的TTC染色和面积大小以及细胞凋亡率的测定，取得可靠的新结果。

我们还针对心肌凋亡用免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达水平，与假结扎组﹑正常组比较，发现模型组Bcl-2/Bax蛋白比值明显下降。已有研究表明：bcl-2基因是调控细胞凋亡信号途径的重要基因，是一种细胞凋亡的抑制基因；而bax则是细胞凋亡的促进基因[8，9]。本实验结果表明模型组Bcl-2/Bax蛋白比值逐渐下调，证明心肌细胞凋亡程度随之增加。

总之，我们成功建立大鼠在体心肌缺血再灌注损伤实验模型；利用多项指标检测与综合评价，充分证明缺血再灌注损伤明显引起心肌细胞凋亡和梗死面积增加；明确了MI/R建模所需检测的心电图、病理生理学(免疫组化法、TUNEL法)和血清学等指标的检测方法，为今后相关的实验研究提供较可靠的参考依据。

[1] 王淑侠，兰小莉，王吉文，等.大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型的改进与评价[J].解剖学进展，2000，6(4):371-373.

[2] 王显刚，殷惠军，史大卓.蒺藜总皂苷对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的影响[J].解放军医学杂志，2006，31(6):531-533.

[3] 陈孝平，石应康.外科常用实验方法及动物模型的建立[M].第1版.北京:人民卫生出版社，2003.145-149.

[4] 王 静，李东野，夏 勇，等.转染Akt1基因对缺血再灌注大鼠心肌线粒体通透性转换的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(1):80-85.

[5] Tsang A,Hausenloy DJ,Mocanu MM,et al. Postconditioning： a form of“modified reperfusion” protects the myocardium by activating the phosphatidy linositol 3-kinase-Akt pathway[J].Circ Res,2004,95(3):230-232．

[6] Henriques JP, Gheeraert PJ, Ottervanger JP, et al. Ventricular fibrillation in acute myocardial infarction before and during primary PCI [J]. Int J Cardiol,2005,105(3):262-266.

[7] Fu YH, Lin QX, Li XH, et al.A novel rat model of chronic heart failure following myocardial infarction[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol,2009,31(6):367-373.

[8] Brown R. The bcl-2 family of proteins [J]. Br Med Bull,1997,53(3):466-477.

[9] Reed JC. Double identity for proteins of the Bcl-2 family [J]. Nature,1997,387(6635):773-776.

Establishmentandevaluationofratheartischemia-reperfusioninjurymodelinvivo

DENG Yu-jun1, FU Yong-heng3, TAN Ning2, ZENG Hong-ke1, SHAN Zhi-xin3, LIN Qiu-xiong3, LI Xiao-hong3, DONG Xiao-li2, YU Xi-yong3, YANG Min3, TAN Wei-ping4, SU Jian3

(1DepartmentofEmergencyandCriticalCare，2GuangdongCardiovascularInstitute，3ResearchCenterofMedicalSciences，4DepartmentofLibrary,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:tanning100@126.com)

AIM: To establish and evaluate a rat model of heart ischemia-reperfusion injuryinvivo.METHODSSeventy-two male Sprague-Dawley rats weighing(250±50)g were randomly divided into sham operation group(sham), ischemia-reperfusion group(I/R) and normal group. The animals were anesthetized and heparinized. Myocardial ischemia-reperfusion was induced by ligating the left anterior descending coronary artery with “U-shape tube” for 35 min followed by 120 min or 240 min reperfusioninvivo. The heart infarct size was measured by triphenyltetrazolium chloride(TTC) staining. The myocardial cell apoptotic index was determined by the method of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling(TUNEL). Immunohistochemical method was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax in rat ischemia myocardium. The blood level of MB isoenzyme of creatine kinase(CK-MB),cardiac troponin I(cTnI),nitric oxide(NO),malondialdehyde(MDA), total superoxide dismutase(T-SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px) were detected after reperfusion for 2 h and 4 h.RESULTSCompared with normal group and sham group, there were obvious changes of ST-T segment and Q wave in the electrocardiogram of I/R group. The blood level of CK-MB, cTnI, NO, MDA and GSH-Px in I/R group increased(P<0.05,P<0.01) after reperfusion for 2 h and 4 h, and the blood level of T-SOD in I/R group after reperfusion for 2 h and 4 h also increased(P<0.05). The heart infarct size in I/R group was the largest as compared to other groups. Among these groups, the apoptotic index of I/R group was the highest and the Bcl-2/Bax ratio in I/R group decreased(P<0.01).CONCLUSIONThe rat model of heart ischemia-reperfusion injuryinvivocan be successfully established with the “U-shape tube”. There are obviously changes of heart infarct size, blood level of CK-MB, cTnI, NO, MDA, T-SOD and GSH-Px, myocardial apoptotic index and Bcl-2/Bax ratio between I/R rats and control animals.

Rats; Reperfusion injury; Apoptosis

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-040

1000-4718(2011)02-0412-05

2010-10-08

2010-12-27

广东省科技计划资助项目(No.2008B030301166)；广东省自然科学基金资助项目( No.9151008002000002)

△通讯作者 Tel：020-83827812；E-mail： tanning100@126.com