不同浓度葡萄糖、胰岛素对新生大鼠心肌细胞脂联素表达的影响

王 梅， 杨 蓉， 王亚玲， 刘金明， 李拥军， 张 辉， 奇 钊

(河北医科大学第二医院心内科， 河北 石家庄 050000)

不同浓度葡萄糖、胰岛素对新生大鼠心肌细胞脂联素表达的影响

王 梅， 杨 蓉， 王亚玲， 刘金明， 李拥军△， 张 辉， 奇 钊

(河北医科大学第二医院心内科， 河北 石家庄 050000)

目的观察心肌细胞能否表达脂联素(APN)，并探讨高糖、高胰岛素状态下心肌细胞APN表达的变化。方法Sprague-Dawley(SD)大鼠的乳鼠心肌细胞原代培养，分为葡萄糖6组：高渗对照组、5.5 mmol/L组、20 mmol/L组、25 mmol/L组、30 mmol/L组和50 mmol/L组。胰岛素6组：0 mol/L组、10-10mol/L组、10-9mol/L组、10-8mol/L组、10-7mol/L组和10-6mol/L组。干预48 h,用RT-PCR法测定心肌细胞APNmRNA表达的差异，并检测心肌细胞APN蛋白表达的变化。结果在葡萄糖浓度小于30 mmol/L组中，心肌细胞APN表达随葡萄糖浓度的增加而减低(P<0.05)，30 mmol/L和50 mmol/L组APN表达显著差异；渗透压对于心肌细胞APN表达无影响；在胰岛素浓度低于10-7mol/L组中，心肌细胞APN表达随胰岛素浓度的增加而减低(P<0.05)，在高于10-7mol/L组中，心肌APN表达无显著差异。结论心肌细胞能够表达脂联素。在一定范围内，随葡萄糖、胰岛素浓度增加，心肌细胞APN的表达水平下降。

心肌细胞； 脂联素； 葡萄糖； 胰岛素； 大鼠

胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)作为2型糖尿病的主要病理生理基础，在2型糖尿病的发生发展中起到关键作用，是糖尿病发生心血管并发症的重要危险因子[1]。脂联素(adiponectin, APN) 是近年来发现的由脂肪细胞分泌与胰岛素抵抗关系最密切的特异性细胞因子，被认为是胰岛素抵抗的标记物[2]。脂联素的表达受一系列激素和环境因素影响。近期有学者发现肌肉组织、肝脏亦能表达脂联素。目前，仅有少数国外文献表明心肌细胞可以表达脂联素，但高血糖和高胰岛素对心肌细胞APN表达有何影响，国内外尚未见相关报道。本研究应用不同浓度葡萄糖、胰岛素对体外培养的心肌细胞进行干预，观察其对心肌细胞APN表达的影响。

材 料 和 方 法

1动物

2-3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠由河北医科大学实验动物中心提供。

2药品与试剂

DMEM低糖培养液、D-Hanks、Ⅱ型胶原酶干粉、Trizol均为Gibco产品；胰蛋白酶干粉为Hyclone产品；新生牛血清、D-甘露醇、牛胰岛素、多聚甲醛为Sigma产品；双抗为Invitrogen产品；BrdU为Boster产品；多聚赖氨酸为Amresco产品；APN抗体为Abcam产品； PCR扩增试剂为Promega产品；RT-PCR检测试剂盒为大连宝生工程有限公司产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；琼脂糖为北方同正产品；其它试剂均为分析纯。混合酶消化液配置方法：胰蛋白酶干粉0.08 g, Ⅱ型胶原酶干粉0.032 g，加入37 ℃预热的D-Hanks液至80 mL，摇匀，过滤除菌，即用即配。

3心肌细胞培养方法

取新生2-3 d的SD大鼠，在无菌的条件下，开胸取出心脏，用D-Hanks液冲洗3次后剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，加入混合酶消化液，取消化完毕后的上清液，200目细胞网筛过滤，所得细胞悬液差速贴壁后以1×109cells/L接种于6孔板，加入5-溴脱尿苷(BrdU，0.1 mmol/L)，在二氧化碳孵育箱内以含10%血清的低糖DMEM培养基培养。

4实验分组及给药方法

常规培养心肌细胞48 h后，换液为无血清的低糖DMEM培养基培养24 h。之后将6孔板上的细胞每3孔分为1组，共分12组，换培养基的同时进行分组干预，继续培养48 h。分组如下：(1)葡萄糖干预，高渗组(含有5.5 mmol/L葡萄糖和45 mmol/L甘露醇，其渗透压与50 mmol/L高糖组相当，所含糖浓度与5.5 mmol/L组相当，用以排除渗透压变化对于心肌细胞脂联素表达的影响)、5.5 mmol/L组、20 mmol/L组、25 mmol/L组、30 mmol/L组、50 mmol/L组；(2)胰岛素干预,0 mol/L组、10-10mol/L组、10-9mol/L组、10-8mol/L组、10-7mol/L组、10-6mol/L组。

5RT-PCR检测APNmRNA的表达

引物序列如下:ANP正义链 5’-CAGGAGATGCTGGAATGA-3’，反义链 5’-GATACTGGTCGTAGGTGAAG-3’；β-actin正义链 5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反义链 5’-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3’。按照Trizol试剂说明书提取心肌细胞总RNA并进行逆转录反应, 共35个循环，PCR产物10 μL经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶 染色、照相并经光密度仪扫描分析,以β-actin吸光度值进行标准校正,计算APN产物的相对量。

6心肌细胞APN蛋白表达水平的检测

裂解液裂解细胞后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。利用水浴式电印迹法将蛋白转至PVDF膜上，室温下封闭4 h后，加入兔抗APN多克隆抗体稀释液，4 ℃ 过夜，用含体积分数为0.5% Tween-20的PBS缓冲液(TPBS)洗3遍，再加入荧光染料标记的羊抗兔IgG(1∶5 000，Rockland IRDye800CW)Ⅱ抗稀释液，37 ℃振摇1 h后用TPBS液洗3遍，用Odyssey9120双色红外激光成像系统仪器扫描PVDF膜后用成像分析软件进行分析，计算每组与β-actin表达量的比值。

7统计学处理

结 果

1葡萄糖浓度小于30 mmol/L组，心肌细胞APN mRNA表达随葡萄糖浓度的增加而减低(P<0.05)。30 mmol/L组和50 mmol/L组比较，APN mRNA表达无显著差异。高渗组与相同糖浓度的5.5 mmol/L组比较APN mRNA表达无显著差异,见图1、表1。胰岛素浓度小于10-7mmol/L组，心肌细胞APN mRNA表达随胰岛素浓度的增加而减低(P<0.05)。10-7mmol/L组和10-6mmol/L组比较，APN mRNA表达无显著差异，见图2、表2。

Figure 1. The expression of APN mRNA in cardiomyocytes treatd with different concentration glucose.

表1 不同糖浓度刺激下心肌细胞脂联素表达的变化

表2 不同胰岛素浓度刺激下心肌细胞脂联素表达的变化

2葡萄糖浓度小于30 mmol/L组，心肌细胞APN蛋白表达随葡萄糖浓度的增加而减低(P<0.05)。30 mmol/L组和50 mmol/L组比较，APN表达无显著差异。高渗组与相同糖浓度的5.5 mmol/L组比较，APN蛋白表达无显著差异，见图3、表1。胰岛素浓度小于10-7mmol/L组，心肌细胞APN蛋白表达随胰岛素浓度的增加而减低(P<0.05)。10-7mmol/L组和10-6mmol/L组比较，APN蛋白表达无显著差异，见图4、表2。

Figure 3. The expression of APN protein in cardiomyocytes treated with glucose at different concentrations.

Figure 4. The expression of APN protein in cardiomyocytes treated with insulin at different concentrations.

讨 论

脂联素的表达受一系列激素和环境因素影响：糖皮质激素、β-肾上腺素能受体激动剂、肿瘤坏死因子(TNF-α)使脂联素表达下降；体重减轻、寒冷刺激、肾上腺切除、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素增敏剂噻唑烷二酮使脂联素表达增加。脂联素具有调节机体能量代谢、改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、抗炎等生物活性[3，4]。脂联素在健康机体血浆中含量丰富，但在冠心病、肥胖、2型糖尿病及原发性高血压等疾病状态下，脂联素水平下降，且其下降程度与病情严重程度相关[5,6]。

血浆中的脂联素主要由脂肪细胞分泌。糖尿病状态下循环脂联素浓度的变化主要由脂肪细胞分泌脂联素量的变化决定。有研究认为[7-9]，一定范围内的高浓度葡萄糖或者胰岛素可使脂肪细胞表达脂联素下降。脂联素下调可能和高糖、高胰岛素状态或胰岛素抵抗有关。葡萄糖以剂量依赖方式降低基础和胰岛素刺激的葡萄糖摄取率。暴露于高糖环境中的脂肪细胞可以出现胰岛素抵抗，葡萄糖摄取下降，脂联素表达减低。有学者发现，1型糖尿病患者的血浆脂联素浓度明显高于体重指数(BMI)相匹配的正常对照组，并且在胰岛素治疗前后，1型糖尿病患者血浆脂联素浓度没有显著变化。有学者[10]用高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验形成受试者血糖浓度保持不变的单纯高胰岛素血症模型，结果发现与基础胰岛素浓度相比，受试者的血浆脂联素浓度显著下降。Pattaranit等[11]研究表明TZD治疗组的胰岛素敏感性、脂联素表达和分泌较二甲双胍治疗组增加，且双胍治疗组对脂联素浓度没有影响，2组患者治疗后的血糖下降无差异。因此认为高血糖可能不是脂肪细胞脂联素表达改变的决定因素。胰岛素抵抗或胰岛素浓度可能是主要因素，高血糖对血浆脂联素的作用可能是通过胰岛素抵抗或其它影响因素介导的。

目前，关于脂联素的研究多集中在脂肪细胞中。近期人们发现，脂联素还可在肝细胞、骨骼肌细胞表达。那么心肌细胞是否表达脂联素？高血糖和高胰岛素血症状态下对心肌细胞脂联素表达有何影响，目前国内外尚无相关报道。

本研究通过差速贴壁法进行乳鼠心肌细胞的体外培养，最终检测心肌细胞的脂联素表达。正常大鼠血糖波动于3.0-6.0 mmol/L，本实验以5.5 mmol/L组模拟正常糖环境，以20、25、30、50 mmol/L组分别模拟不同浓度的高葡萄糖病理状态。本实验结果发现， 5.5 mmol/L葡萄糖组的脂联素表达显著高于20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L组，说明正常糖环境中心肌细胞脂联素表达较高，而随葡萄糖浓度的增加，心肌细胞脂联素表达下降，但是30 mmol/L组与50 mmol/L组的脂联素表达无显著差异。说明高糖在一定范围内下调心肌细胞表达脂联素，但超过这一范围，脂联素表达不再符合此趋势。高渗组的脂联素表达与5.5 mmol/L组无显著差异，但明显高于50 mmol/L组，说明高糖对于心肌细胞脂联素表达的影响是糖浓度造成的，而非渗透压。正常大鼠血浆胰岛素空腹波动于10-10mol/L上下，餐后升高5-6倍。本实验以10-10mol/L组模拟正常糖环境，说明高浓度胰岛素环境中，心肌细胞脂联素表达下调，并且在一定限度内，随胰岛素浓度递增脂联素表达递减，但是超过这一范围，脂联素表达不再明显下降。

本实验首次证明了高葡萄糖、高胰岛素下调心肌细胞脂联素的表达。有研究表明，2型糖尿病患者脂联素表达过低可能与高胰岛素状态下MAPK功能失调有关，p42/p44MAPK的抑制剂可部分逆转胰岛素抑制脂联素表达的效应[12]。在高糖、高胰岛素状态下，心肌细胞是通过何种分子机制下调脂联素表达的，仍有待进一步探讨。

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Influenceofglucoseandinsulinonexpressionofadiponectioninneonatalratcardiomyocytes

WANG Mei, YANG Rong, WANG Ya-ling, LIU Jin-ming, LI Yong-jun, ZHANG Hui, QI Zhao

(DepartmentofCardiology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.E-mail:lyjbs2009@yeah.net)

AIM: To study the influence of glucose or insulin at different concentrations on the expression of adiponectin in cardiomyocytes.METHODSMyocardial cells were isolated from the hearts of neonatal Sprague-Dawley rats and primarily cultured. The cells stimulated with glucose at concentrations of 5.5, 20, 25, 30, and 50 mmol/L respectively were divided into 5 groups and a hypertonic control group was set up. The cells treated with insulin at concentrations of 0, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7and 10-6mol/L were also divided into 6 groups. The mRNA and protein levels of adiponectin(APN) were determined by RT-PCR and Western blotting 48 h after the intervention with glucose or insulin.RESULTS(1) The expression of adiponectin decreased with the elevation of glucose concentration at the doses lower than 30 mmol/L(P<0.05). When higher than 30 mmol/L, the expression of adiponectin didn’t change significantly. The osmotic pressure did not affect the adiponectin expression in cardiomyocytes.(2) The expression of adiponectin decreased with the elevation of insulin concentration at the doses lower than 10-7mmol/L(P<0.05). When higher than 10-7mmol/L, the expression of adiponectin didn’t change significantly.CONCLUSIONThe expression of APN decreases with the elevation of glucose or insulin concentrations within a certain range of dosage.

Cardiomyocytes; Adiponectin; Glucose; Insulin; Rats

R322.1+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-030

1000-4718(2011)02-0371-04

2010-07-26

2010-11-17

△通讯作者 Tel: 0311-66002173; E-mail:lyjbs2009@yeah.net