胃癌术前适形放疗的蛋白表达谱变化及意义*

蒋明东, 李少林, 仝蜀生, 李铁军, 王正洪, 赵 瑜, 黄小波, 徐永柱

(重庆市第九人民医院 1肿瘤血液科并放疗中心,3普外科,重庆400700；2重庆医科大学基础医学院放射教研室，重庆400016; 4重庆市卫生信息中心,重庆400014)

胃癌术前适形放疗的蛋白表达谱变化及意义*

蒋明东1, 李少林2, 仝蜀生3, 李铁军3, 王正洪1, 赵 瑜1, 黄小波1, 徐永柱4△

(重庆市第九人民医院1肿瘤血液科并放疗中心,3普外科,重庆400700；2重庆医科大学基础医学院放射教研室，重庆400016;4重庆市卫生信息中心,重庆400014)

目的探讨胃癌术前适形放疗作用后的蛋白表达谱变化及意义。方法选择有病理诊断的胃癌患者，随机分组行单纯手术和适形放疗+手术，术后收集肿瘤组织标本。以固相pH 梯度等电聚焦(IPG-IEF) 为第一向、垂直平板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 为第二向进行胃癌组织蛋白质分离；用图像分析软件 PDQuest 8.0 分析电泳图谱，寻找有意义的差异蛋白点；运用MALDI-TOF质谱鉴定，并对其中差异显著蛋白采用Western blotting 和RT-PCR进行鉴定，检测蛋白表达谱变化。结果胃癌适形放疗组与对照组的蛋白表达谱明显不同，发现3个有意义的差异蛋白质点，适形放疗组肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)、c-erbB-2和表皮生长因子受体(EGFR)的表达降低，与对照组比较差异显著(P<0.01)。结论胃癌术前适形放疗可以降低胃癌细胞相关表皮蛋白表达。这些蛋白可能成为胃癌治疗新的靶点。

胃肿瘤； 蛋白质组

胃癌临床治疗以外科手术为首选，但术后复发率较高，在进展期和中晚期胃癌患者更为突出[1,2]。因此，寻找更加有效的联合治疗方案成为临床医生和医学基础研究者追求的目标。 三维适形放疗(3-dimensional conformal radiation therapy，3D-DCRT)是一种提高治疗的物理措施，通过适形放疗能够提高肿瘤的局部控制率进而提高生存率[3,4]。目前3D-CRT已广泛应用于鼻咽癌、前列腺癌和肺癌等的临床治疗，比传统放射治疗有明显的优势。本研究选3D-CRT术前放疗胃癌病人，休息3-4周后进行手术，采集术后胃癌组织，用蛋白质组学方法检测胃癌相关蛋白表达变化，以探讨胃癌病人术前3D-CRT抑癌作用的分子机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要试剂和仪器 牛血清白蛋白(BSA) 蛋白定量检测试剂盒(Bio Teke Corporation)，固相pH 梯度(IPG) 胶条(pH 4-7，17 cm，Bio-Rad)，尿素、硫脲(Sigma)，二硫苏糖醇(Bio-Rad)，十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸、丙烯酰胺、TEMED(美国Bio-Rad)。载体两性电解质、等电聚焦(IEF) 覆盖液和低熔点琼脂糖(Amersham Pharmacia)，乙腈(Bake)，三氟乙酸(Sigma)。凝胶/ 发光图像分析系统ChemiDoc XRS和PDQuest 2D 图像分析软件(Bio-Rad)，三维适形放疗治疗计划系统(3D-TPS)(Elekta)，6MV-直线加速器(Elekta)，双螺旋CT(Siemens)，真空冻干机(Christ Alpha)，质谱分析仪(ABI Voyager DE-Pro MALDI - TOF - MS)。

1.2病人资料 收集在本院2006年7月-2008年12月住院、临床和病理诊断为胃癌的病例26例，其中男16例，女10例，年龄在45-72岁，平均年龄为58岁，Ⅲ-Ⅳ期，均系自愿入组并签署相关知情同意书。随机将患者分成2组，1组术前三维适形放疗+手术为实验组，1组单纯手术为对照组。收取病人手术后胃癌标本，每个病例切下的瘤组织10 g，液氮冻存备用。

2方法

2.1实验组处理 训练患者平静呼吸，在真空垫及体模固定下作治疗定位，双螺旋CT增强扫描，3D-TPS制作优化治疗计划并验证，对实验组胃癌患者进行适形放疗，标准参照文献进行[3,4]，总照射剂量40.0-48.0 Gy/20-24 f，放疗结束后休息2-3周进行手术治疗(不因放疗改变手术方案)。对照组行单纯手术进行。手术后对标本进行大体和组织形态学观察，同时收集各组每个病例瘤组织10 g左右，液氮冻存备用。

2.2标本处理与定量 每个病例瘤组织分取1 g左右，冷PBS洗涤3次，弃上清，每管加入200 μL DIGE裂解缓冲液{7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基}丙磺酸内盐 ，0.2%固相pH 梯度(immobilized pH gradients，IPG)缓冲液，罗氏混合酶抑制剂]，冰浴超声破碎(80 W，每次6 s，间隔10 s，共8次，置于冰上)，然后14 000 r/min离心1 h，收集上清液。使用牛血清白蛋白(BSA) 蛋白定量检测试剂盒测定蛋白质浓度，将实验组和对照组蛋白样品分装于0.5 mL离心管中，-80 ℃低温保存。

2.3双向电泳(2-dimensional electrophoresis,2-DE) 2组胃癌组织蛋白质上样量均300 μg，2-DE操作参照Bio-Rad 公司2-DE 手册进行。

2.4凝胶染色并扫描 参照 Yan等[5]的银染方案进行染色。将染色后的凝胶利用 Image Scanner 光学扫描仪，扫描并备份凝胶图像，再经 PDQuest 8.0 图形分析软件对 2 - DE 图谱进行分析，寻找差异表达蛋白质。挖取重复性和分辨率较好的蛋白质斑点准备质谱分析。

2.5质谱分析 制备好的样品用ABI公司的 Voyager DE-Pro MALDI - TOF质谱仪进行分析。

2.6数据库检索 将获得的肽质量指纹谱数(http:∥www.prospector.ucsf.edu) 进行数据库搜索。参数采用PMF 中的肽片段质量控制在800-3 000，酶解片段不完全选择为1 个，肽片段分子量最大容许误差控制在±1 D，半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸(carbamidomethyl-Cys)，物种来源选择人。

2.7Western blotting和RT-PCR鉴定差异表达蛋白 RNA的提取、反转录和半定量 RT-PCR 按照常规方法进行。磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)在多数人类细胞系中的表达是恒定的，故而用作半定量 RT-PCR 的内参照。蛋白提取采用Qiagen试剂盒提取，上样50 μg，Western blotting按常规进行。

3统计学处理

蛋白质表达谱的差异用Student’st检验，数据处理采用SPSS 11.5软件完成。

结 果

1胃癌大体及组织形态学观察结果

手术后取得的人胃癌组织大体标本实验组可见肿瘤表面部分呈灰白色或苍白色表现，部分纤维变，整体有一定固缩变小；而对照组肿瘤表面呈高低不平的外凸，暗红色表现，无纤维变。对照组低倍镜(图1A1)可见癌细胞浸润生长，形成癌性腺体，高倍镜(图1A2)可见癌细胞沿腺体壁浸润，大小不一；实验组低倍镜(图1B1)可见浸润生长的癌细胞排列紊乱，癌性腺体固缩，高倍镜(图1B2)可见癌细胞体积变小，部分细胞呈空化变；实验组另一视野低倍镜(图1B3)可见肿瘤血管塌陷、闭塞，管腔内可见血栓形成，高倍镜(图1B4)可见塌陷的肿瘤血管壁细胞固缩，体积变小。

Figure 1. Morphology of gastric cancer tissues in control and experimental groups. Cancer cells grew invasively and formed glands(arrow) in control group(A1, ×100; A2, ×400). Caner tissues in experimental group, with derangement(B1, ×100), shrinkages of cell size and carcinous glands(B2, ×400). Blood vessels in experimental group were destroyed with the occurrence of embolism(B3, ×100),and the cells of vessel walls were shrunk(B4, ×400).

2胃癌组织蛋白质电泳图结果比较

本实验所得电泳图谱具有可重复性，蛋白质点主要集中在 pH 4-7 区域，从左到右PI增加，纵向自上而下相对分子质量减少。对得到的电泳图运用 PDQuest 8.0 软件分析，检测到的蛋白质斑点数，对照组胃癌组织为 410个蛋白质点，适形放疗组胃癌组织为 378 个蛋白质点。由软件自动选取差异大于2倍的斑点，两组比较共发现 12个差异蛋白质点，适形放疗组胃癌组织3个蛋白点量上调，9个蛋白点表达下调，其中3个蛋白表达下调明显,见图2。

3MALDI-TOF质谱鉴定结果

切下适形放疗组与对照组胃癌组织的差异蛋白点进行酶解，采用质谱分析技术MALDI-TOF-MS 鉴定， 差异蛋白点的性质见表1 。

4差异表达蛋白质的归类

经过质谱分析筛选共得到7个表达差异的蛋白点，其中有2个差异蛋白点经鉴定属于同一种蛋白质，因此最终得到6个具有统计学意义的胃癌组织表达差异蛋白点，与对照组比较差异显著(P<0.01)，其中3个表达上调(以“+”号表示，未列出)，3个表达下调(以“-”号表示，见表1)。其中3个表达下调明显的蛋白主要是与代谢酶类以及细胞信号转导、细胞表皮生长、细胞增殖和凋亡有关的蛋白质。

Figure 2. Differentially expressed protein spots in 2-dimensional electrophoresis image in gastric tumor tissues with(B) or without(A) conformal radiation therapy.

表1 经MALDI - TOF质谱技术鉴定的差异表达蛋白

5差异表达蛋白的RT-PCR及Westernblotting验证

RT-PCR检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和c-erbB-2转录水平的结果显示，三者在术前三维适形放疗组胃癌组织中表达降低，而且部分胃癌组织表达缺失，见图3A。Western blotting 结果与RT-PCR结果一致，见图3B。

讨 论

放射治疗不是胃癌的首选治疗，但已有报道术前放疗可使60%的胃癌不同程度地缩小，可提高手术切除率和治愈性切除率，使5年存活率提高10%-20%[2,5]。近年来3D-CRT的出现，更加扩大了放疗在恶性肿瘤治疗中的应用范围。3D-CRT能够极大地提高病灶靶区的放射剂量，同时病灶区周围正常组织和器官得到最好的保护，因此3D-CRT成为临床治疗中晚期胃癌病人的有效姑息手段[3,6]。在本研究中，我们采用三维适形放射治疗手段，对中晚期胃癌病人进行术前治疗，取得了一定的临床治疗优势：与对照组相比，病人术中出血减少，肿瘤块均有一定缩小，手术时间缩短，术后恢复较快。术后的胃癌组织标本大体(肉眼)观察和组织形态学观察也佐证了术前3D-CRT对胃癌的手术治疗有着积极的作用，在胃癌的综合治疗中占有重要的地位。

Figure 3. The alteration proteins were detected by RT-PCR and Western blotting. A:RT-PCR;B:Western blotting.±s.n=3. *P<0.05 vs control group

我们选用比较蛋白质组学研究三维适形放射治疗胃癌后的蛋白质表达差异变化。蛋白质组学是以整体蛋白质作为研究对象，为寻找差异表达蛋白提供了一个全新的手段[7-10]。本研究结果显示，与对照组比较，术前三维适形放疗组胃癌组织VEGF、EGFR和c-erbB-2蛋白表达降低，部分表达缺失，说明术前适形放疗对胃癌病灶的作用可能部分是通过影响VEGF、EGFR和c-erbB-2因子及受体表达来完成的。

VEGF、EGFR和c-erbB-2是胃癌细胞的重要相关因子，在胃癌的发生发展中发挥作用。VEGF是胃癌发生发展过程中肿瘤血管生成的重要因子，c-erbB-2出现在胃黏膜癌变过程的后期，是胃黏膜恶性变的标志，EGFR在胃癌发生发展中呈异常水平表达，参与胃癌的发生发展。实验中发现由于术前3D-CRT的作用，胃癌细胞产生VEGF、EGFR和c-erbB-2蛋白差异表达，提示这些差异表达蛋白有可能成为未来胃癌治疗的有效靶标。

(致谢:蛋白质组学研究内容在中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组分析研究中心完成，特此表示感谢!)

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Alterationandsignificanceofproteinexpressionprofileingastriccancerwithpreoperativeconformalradiationtherapy

JIANG Ming-dong1, LI Shao-lin2, TONG Shu-sheng3, LI Tie-jun3, WANG Zheng-hong1, ZHAO Yu1, HUANG Xiao-bo1, XU Yong-zhu4

(1DepartmentofOncologyandHematology,CenterofRadiotherapy,3DepartmentofOrdinarySurgery,TheNinthPeople’sHospitalofChongqingCity,Chongqing400700,China;2TeachingLaboratoryofRadiationforCollegeofPreclinicalMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;4ChongqingHealthInformationCenter,Chongqing400014,China.E-mail:xuyongzhu888@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the alteration and significance of the protein expression profile in gastric cancer with preoperative conformal radiation therapy.METHODSThe pathologically-diagnosed gastric cancer patients were randomly chosen to perform conformal radiation therapy before operation. The patients without conformal radiation treatment served as controls. The tumor tissues were collected after operation from the patients. The alteration of the protein expression profile was detected by 2-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF-MS. The expression of vascular endothelial growth factor(VEGF),c-erbB-2 and epidermal growth factor receptor(EGFR) was detected by RT-PCR and Western blotting.RESULTSCompared with the patients without conformal radiation therapy, the protein expression profile of tumor tissues from gastric cancer patients with conformal radiation therapy was obviously altered. The expression of VEGF, c-erbB-2 and EGFR was differentially reduced(P<0.01).CONCLUSIONThe preoperative accurate conformal radiation therapy reduces the expression of gastric cancer-related epithelial proteins, indicating new therapeutic targets for gastric cancer.

Stomach neoplasms; Proteome

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-011

1000-4718(2011)02-0268-04

2010-08-02

2010-12-02

重庆市卫生局科研基金资助项目(No.07-2-219)

△通讯作者 Tel：023-63635355; E-mail：xuyongzhu888@yahoo.com.cn