原位注射法建立人胰腺癌SW1990裸鼠种植瘤模型及高频内镜超声探头对其的监测

马建霞 司佩任 吴洪玉 王洛伟 潘雪 高军 李兆申 金震东

·论著·

原位注射法建立人胰腺癌SW1990裸鼠种植瘤模型及高频内镜超声探头对其的监测

马建霞 司佩任 吴洪玉 王洛伟 潘雪 高军 李兆申 金震东

目的建立裸小鼠人胰腺癌原位种植瘤模型，探索监测种植瘤生长的方法。方法将对数生长期的人胰腺癌细胞株SW1990制备成细胞悬液，原位注射于Balb/c-nu裸小鼠胰腺尾部包膜下,利用高频内镜超声(EUS)探头体表观察肿瘤结节的生长及声像图像。结果20只裸小鼠均接种成功，1只裸鼠于接种后25 d时死亡。接种后14 d，EUS检查的瘤体大小为(8.09±2.61)mm3，肿瘤结节呈均质低回声,边界清楚,周边有包膜及声晕,形态规则，30%的肿瘤结节周边可见低速环绕彩色血流信号；接种后28 d，瘤体增大至(12.40±3.51)mm3,70%的肿瘤结节呈不规则形,部分为分叶状,肿块呈低回声,不均质,未见液化坏死区，70%的肿瘤结节周边可见低速环绕彩色血流信号。结论原位注射法是建立裸小鼠人胰腺癌原位种植瘤模型较理想的方法，操作简便，成瘤率高；高频内镜超声显像是可靠的监测胰腺原位种植瘤的手段。

胰腺肿瘤； 模型，动物； 内镜超声检查

裸鼠胰腺原位癌模型与人的胰腺癌自然病程一致，而且其肿瘤微环境与人胰腺癌相似，成为胰腺癌实验研究中最常用的动物模型之一。如何更加方便、高效地建立模型，并实时监测裸小鼠胰腺肿瘤的生长成为裸鼠模型成功的研究重点。以往常通过手术方式在胰腺原位种植裸鼠皮下移植瘤组织块的方法。但该法对外科技术要求高，肿瘤组织块可能脱落入腹腔造成腹腔种植。为此，本实验采用原位注射人胰腺癌细胞悬液的方法建立裸鼠胰腺癌原位模型,并采用高频内镜超声探头监测其生长规律及声像图特征。

资料与方法

一、实验动物、试剂及仪器

人胰腺癌细胞株SW1990购自美国ATCC公司，常规培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 ng/ml链霉素的DMEM培养液,每2 d换液，3～4 d传代。20只4～6周龄雄性Balb/c-nu裸鼠，体重18～20 g，购自中科院动物中心，获国家动物品系合格证，于第二军医大学动物中心SPF(specific-pathogen free)级分笼饲养。DMEM细胞培养基、L-谷氨酰胺、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶为北京天来公司产品，胎牛血清为PAA Laboratories GmbH产品。超声探头为Olympus环形扫描超声内镜GF-UE260-α5的75Hz的高频探头。

二、模型制备及监测

取对数生长期SW1990细胞，稀释成1×107/ml细胞悬液。裸鼠麻醉后取右侧位，常规消毒铺巾后剖腹，暴露胰腺尾部，于胰腺尾部包膜下接种0.2 ml细胞悬液(图1a)。术后自由饮水、进食。每日记录裸鼠的一般情况，观察有无手术并发症，称体重。接种14 d及28 d对裸鼠进行超声观测(图1b)。观察前将超声仪和检查探头用1%醋酸洗必泰液搽洗1次,检查室用紫外线灯照射2 h,检查时穿无菌隔离衣。将裸鼠麻醉后置于无菌水中，内镜超声探头水囊充满，贴近裸鼠腹壁，观察肿瘤二维声像图及彩色血流信号，测量肿瘤长、宽、厚三个径线,每个径线均测3次,取平均值,肿瘤体积V=π/6×长×宽×厚。

三、病理学检查

接种后28 d,处死裸鼠,取肿瘤组织及肝脏、肺脏、腹膜等组织，常规行病理学检查。

结 果

一、裸鼠一般状况

20只裸鼠接种后7 d饮水、进食正常，以后逐渐开始出现纳差，活动力减弱，28 d后均出现消瘦、恶液质等表现。接种后25 d有1只裸鼠死亡，解剖后发现死于胰腺癌腹腔种植，并发肠梗阻。荷瘤鼠在7、14、21、28 d的平均体重分别为19.2、20.5、18.7、17.0 g。

二、超声观察结果

20只裸小鼠均接种成功。接种后14 d，超声检查裸鼠胰腺原位均形成瘤结节，大小为(8.09±2.61)mm3，呈均质低回声,边界清楚,周边有包膜及声晕,形态规则，30%的肿瘤结节周边可见低速环绕彩色血流信号。接种后28 d，瘤体增大至(12.40±3.51)mm3,70%的肿瘤结节呈不规则形,部分为分叶状,肿块呈低回声,不均质,未见液化坏死区，70%的肿瘤结节周边可见低速环绕彩色血流信号(图2)。

图1胰腺原位注射SW1990细胞(a)及裸小鼠胰腺种植瘤的内镜超声探头检查(b)

图2 接种后14 d(a)和28 d(b)裸鼠种植瘤的超声图像

三、种植瘤的病理改变

处死时有3只裸鼠可见血性腹水。胰腺原位肿瘤呈多个灰白色或灰黄色结节、质硬，类圆形、分叶状或结节状(图3a)。光镜下见肿瘤细胞排列紊乱、分化差、核深染,每高倍视野可见核分裂象8～10个,组织内偶见导管及腺泡,可见较多血管腔,并可见微血管，周围胰腺组织正常(图3b)。肺脏均未见转移灶。一只裸鼠肝脏出现转移灶。

图3裸鼠种植胰腺癌的大体标本(a)及病理改变(b，HE ×200)

讨 论

动物模型是肿瘤实验研究的基础，由于裸鼠缺乏胸腺，不具备T细胞免疫力，故对异种移植不产生排斥反应，成活率高[1]，因此，裸鼠是最多用来建立肿瘤模型的动物。裸鼠胰腺癌移植瘤动物模型制备方法主要有三种：人胰腺癌细胞裸鼠皮下种植模型、脾内注射肝转移模型和外科胰腺原位种植模型。

皮下种植肿瘤成功率高,具有易于治疗和观察疗效的优点，但皮下瘤与人的胰腺癌自然病程不一致，且转移灶的肿瘤生物学特性可以与原发灶不同[2]。原位种植法是采用直接来自新鲜外科标本或裸鼠皮下移植瘤组织，通过原位种植于裸鼠胰腺内建立胰腺肿瘤模型。由于原位种植，肿瘤可维持癌细胞来源的组织结构和其生物学特性，在宿主体内以更类似于人类的方式显示其恶性行为。但在胰腺包膜下接种组织块难度较大，容易造成出血、胰瘘

以及组织块脱落等并发症，且手术费时，裸鼠死亡率较高。

1995年Alisaukus等[3]采用原位注射皮下瘤块组织液的方法建立胰腺癌模型，但依然费时。本文采用于胰腺原位直接注射培养的胰腺癌细胞悬液，成瘤率达100%，并发症低，死亡率5%，效果理想。

为监测肿瘤生长情况，通常使用高场强磁共振及临床性线圈急性扫描[4]，耗时长，成本高。我们曾采用超声探头对裸鼠胰腺种植瘤进行监测，但因普通探头过大，频率低，无法对裸鼠这种超小型动物腹腔内肿瘤进行很好地观察，所以我们改用了内镜超声的高频超声探头，结果能清晰地显示荷瘤裸小鼠的胰腺癌结节声像图，且能获得血流信号，为种植瘤提供更多的信息，是一种较理想的监测肿瘤生长的手段。

[1] 孟令新，李强，郭仁德，等．裸鼠胰腺癌动物模型及其应用进展．中华实验外科杂志，2006，23：1583-1584．

[2] Schuetz JD,Schuetz EG.Extracellular matrix regulation of multidrug resistance in primary monolayer culture of adult rat hepatocytes．Cell Growth Differ,1993,4：31-40．

[3] Alisauskus R,Wong GY,Gold DV.Initial studies of monoclonal antibody PAM4 targeting to xenografted orthotopic pancreatic cancer.Cancer Res,1995,55：5743s-5748s．

[4] 何伟，王冬青，孙维斌，等.人胰腺癌细胞株PANC1裸鼠原位模型的建立及磁共振监测.中华胰腺病杂志,2009,9:328-330.

2011-01-13)

(本文编辑：吕芳萍)

Establishoftheorthotopichumanpancreaticcancermodelinmiceandhighfrequencyprobeofendoscopyultrasonographicmonitoring

MAJian-xia,SIPei-ren,WUHong-yu,WANGLuo-wei,PANXue,GAOJun,LIZhao-shen,JINZhen-dong.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

JINZhen-dong,Email:zhendjin@126.com

ObjectiveTo establish the orthotopic human pancreatic cancer model in mice and study the method to detect the tumor growth.MethodsHuman pancreatic cancer cell lines SW1990 in logarithmic phase was made into cell suspension and in situ injected into the envelope of pancreatic tail of BALB/c nude mice. High-frequency endoscopy ultrasound was used to observe the growth of tumor mass and its imaging characteristics were studied.Results20 nude mice were successfully implanted, and 1 died 25 h after implantation. 14 days after implantation, the tumor of pancreatic cancer on EUS was(8.09±2.61)mm3, the tumor appeared as homogeneous hypoechoic mass with clear boundary, and envelope as well as sound halo was present, and the shape was regular; there was low speed circular vasculature signal in around 30% of tumor. The tumor size increased to (12.40±3.51)mm3, and the shape of 70% tumor was irregular, and some appeared as lobulated, and the tumor appeared as heterogeneous hypoechoic mass, no necrosis or liquefaction was found 28 days after implantation. There was low speed circular vasculature signal in around 70% tumors.ConclusionsThe orthotopic pancreatic cancer model in nude mouse can be established by in situ injection and this method is relatively ideal because it is simple and effective. The high frequency probe of endoscopic ultrasonograph is a reliable method for monitoring implanted pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Model, animal; Endoscopy Ultrasonography

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.013

国家自然科学基金(C171006)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

金震东，Email:zhendjin@126.com