S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响

王晓燕 周永静 龚丹丹 许亚平 徐岷 范钰

·论著·

S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响

王晓燕 周永静 龚丹丹 许亚平 徐岷 范钰

目的探讨S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响和可能机制。方法将不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)的靶向S100A6的小干扰RNA(S100A6-siRNA)转染人胰腺癌BxPC3细胞，分别采用荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测S100A6 mRNA和蛋白的表达，采用Transwell小室检测癌细胞侵袭能力，明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性。结果S100A6-siRNA转染组细胞的S100A6 mRNA和蛋白表达呈浓度、时间依赖性明显下调，穿膜细胞数呈浓度依赖性明显减少。12.5 nmol/L的S100A6-siRNA转染组细胞转染后48 h的S100A6 mRNA表达从对照组的(100±0.3)%降到(15.3±0.2)%(P<0.01)；S100A6蛋白的表达从(83.2±0.18)%降到(13.5±0.12)%(P<0.01)；穿膜细胞数从(44.5±2.2)个降到(7.6±1.5)个(P<0.05)。同时，S100A6-siRNA转染组细胞的MMP-9活性明显下调。结论抑制S100A6基因表达可抑制胰腺癌细胞侵袭转移，其机制可能与下调MMP-9活性有关。

胰腺肿瘤； S100A6； 肿瘤侵润； 基质金属蛋白酶类

S100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族，S100A6蛋白是其成员之一。研究发现，S100A6蛋白在一些实体瘤如大肠癌、肺腺癌和骨肉瘤中高表达，且与癌细胞侵袭有关。同样，S100A6在胰腺癌中高表达，而癌旁组织无表达[1-2]，且与癌细胞侵袭及不良预后密切相关[3-5]，但其分子机制尚不清楚。本研究以靶向S100A6基因小干扰RNA(siRNA)转染胰腺癌BxPC3细胞，观察其对胰腺癌细胞侵袭的影响，探讨其可能的机制。

材料和方法

一、细胞培养及转染

人胰腺癌BxPC3细胞株为本院组织细胞生物库冻存，常规培养传代。取1.0×105个对数生长期细胞接种于24孔培养板，1 ml/孔。待细胞达到70%融合时，分为对照组、脂质体组和S100A6-siRNA组。S100A6-siRNA根据文献[5]设计，靶点区域为AAGCTGCAGGATGCTGAAATT，由美国Dharmacon公司合成。应用LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)将不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L) 的S100A6-siRNA转染细胞，按说明书操作。对照组未经任何处理；脂质体组仅在培养液中添加LipofectamineTM2000。每组设3个复孔。转染后24、48、72 h分别采用胰酶消化收集细胞。

二、胰腺癌细胞S100A6 mRNA 和蛋白的检测

收集的细胞以Trizol抽提总RNA。取总RNA 1 μg，以oligo dT(15 mer)为引物逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板进行定量PCR，步骤和PCR反应条件参照文献[6]。S100A6上游引物5′-AAGCTGCAGGATGCTGAAAT-3′；下游引物5′-CCCTTG-AGGGCTTCATTGTA-3′。GAPDH为内参。mRNA表达的定量方法参照文献[6]。

收集各组细胞，提取细胞总蛋白，常规行蛋白质印迹法检测S100A6蛋白的表达，以β-actin为内参。利用Kodak Digital Science 1D图像分析软件测定条带灰度值，以S100A6与β-actin条带的灰度百分值作为S100A6蛋白的相对表达量。

三、体外侵袭实验

使用BD公司生产的滤膜包被Matrigel的侵袭小室。上、下室各加入37℃的无血清培养液0.5 ml，置培养箱内静置2 h后弃培养液。上室分别加入500 μl无血清培养基悬浮的2.5×104/ml的各组BxPC3细胞，下室加入500 μl含10%FBS的培养基。将侵袭小室置于24孔培养板内常规培养48 h。每组3个小室。用棉拭子去除上室未穿膜细胞，用4%甲醛固定滤膜30 min，PBS漂洗2次，0.5%结晶紫染色30 min，PBS冲洗。随机选择5个200倍视野，计算总细胞数，取3个小室的均值表示肿瘤细胞的侵袭能力。

四、MMP-9活性检测

采用明胶酶谱方法检测。收集50 μl培养上清，加入10 μl样品缓冲液，混匀后不加热直接在含1 mg/ml明胶蛋白的10%聚丙烯酞胺凝胶上行垂直电泳。电泳结束后将凝胶置于培养皿中，加入100 ml 2.5%Triton-X 100振荡，重复洗6次，每次5 min。再用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)冲洗3次，每次5 min。之后将凝胶放入反应液中[50 mmol/L Tris(pH 7.4)、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2)]置37℃培养24 h，考马斯亮蓝R250染色4 h后用脱色液(30%甲醇、10%冰醋酸)脱色，直至出现明显、清晰的负染酶带。

五、统计学处理

结 果

一、S100A6-siRNA对BxPC3细胞S100A6 mRNA和蛋白表达的影响

S100A6-siRNA组细胞的S100A6 mRNA和蛋白表达呈浓度和时间依赖性降低(P值均<0.01，表1)。

表1 BxPC3细胞S100A6 mRNA和蛋白表达的变化

注：与脂质体组比较，aP<0.01；S100A6-siRNA组间比较，bP<0.01

二、S100A6-siRNA对BxPC3细胞侵袭力的影响

培养48 h后，对照组、脂质体组及3.125、6.25、12.5 nmol/L S100A6-siRNA组的穿膜细胞数分别为(44.5±2.2)、(43.8±2.1)、(28.6±1.6)、(15.6±1.8)、(7.6±1.5)个(图1),S100A6-siRNA呈浓度依赖性减少穿膜细胞数量(P<0.05)。

图1 对照组(a)和S100A6-siRNA组(b)的穿膜细胞数量

三、S100A6-siRNA对细胞MMP-9活性的影响

S100A6-siRNA组细胞的MMP-9活性较对照组显著下降(图2)。

图2 对照组和S100A6-siRNA组细胞的MMP-9活性

与S100蛋白家族其他成员一样，S100A6蛋白具有EF双螺旋结构的氨基酸序列(手型Ca2+结合区)。当此区与Ca2+结合后，S100蛋白构象就发生改变，暴露出其与靶蛋白结合的位点，进而通过相应的靶蛋白发挥其生物学效应[6]。

本实验以靶向S100A6的siRNA转染胰腺癌BxPC3细胞，结果显示转染后细胞S100A6 mRNA和蛋白表达明显下降，且细胞侵袭能力明显降低，说明S100A6的下调可抑制胰腺癌细胞的恶性侵袭能力。

肿瘤侵袭和转移过程是瘤细胞从原发瘤脱离后向周围和(或)远处组织侵袭和转移的过程，涉及瘤细胞穿过细胞外基质(extra celluar matrix，ECM)、血管壁基底膜及穿出血管壁进入微环境的过程。研究发现，癌细胞侵袭转移能力与其诱导产生蛋白酶降解ECM和基底膜的能力密切相关[7-8]。文献报道[9-10]，MMPs在胰腺腺癌细胞的侵袭和转移中起重要的作用。本结果显示，S100A6-siRNA组癌细胞的MMP-9活性明显下降，提示MMP-9参与了S100A6对胰腺癌细胞侵袭的调控。至于其内在的分子机制，尚需要进一步深入研究。

[1] Ishii A,Suzuki M,Satomi K,et al.Increased cytoplasmic S100A6 expression is associated with pulmonary adenocarcinoma progression.Pathol Int,2009,59:623-630.

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2010-07-05)

(本文编辑：吕芳萍)

EffectsofS100A6genesilenceoninvasionofhumanpancreaticcarcinomacell

WANGXiao-yan,ZHOUYong-jing,GONGDan-dan,XUYa-ping,XUMin,FANYu.

CancerInstitute,AffiliatedPeople′sHospital,JiangsuUniversity,Zhenjiang212002,China

FANYu,Email:yuf36@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of S100A6 gene on invasion of human pancreatic cancer cell and possible mechanism.MethodsHuman pancreatic cancer BxPC3 cell line was transfected with small interfering RNA (siRNA) targeting S1006 gene, the mRNA and protein levels of S100A6 were determined by real time RT-PCR and Western blotting respectively. The invasion ability was evaluated by Transwell chamber. The matrix metalloproteinase-2 (MMP-9) activity of cancer cells was examined by gelatin zymography.ResultsThe levels of mRNA and protein of S100A6 were greatly reduced in a dose and time dependent manner, the number of penetrating cells was greatly reduced in a dose dependent manner. The expression of S100A6 mRNA in 12.5 nmol/L of S100A6 siRNA transfected group decreased from (100±0.3)% in control group to (15.3±0.2)%; while the expression of S100A6 protein decreased from (83.2±0.18)% to (13.5±0.12)%; the number of penetrating cells decreased from 44.5±2.2 to 7.6±1.5(P<0.01). The MMP-9 activity of siRNA group reduced significantly.ConclusionsS100A6 siRNA can inhibit the invasion of pancreatic cancer cells through down-regulation of MMP-9.

Pancreatic neoplasms； S100A6； Neoplasms invasiveness； Matrix metalloproteinases

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.010

镇江市社会发展基金(SH2009204)

212002 江苏镇江，江苏大学附属人民医院肿瘤研究所(王晓燕、周永静、龚丹丹、许亚平、范钰)；江苏大学附属医院消化科(徐岷)

范钰，Email：yuf36@sina.com