斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制研究

李伟 陈政 宗洋 龚斐然 朱毅 殷红 徐泽宽 陶敏 苗毅

·论著·

斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制研究

李伟 陈政 宗洋 龚斐然 朱毅 殷红 徐泽宽 陶敏 苗毅

目的研究斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制。方法用斑蝥素处理PANC1、CFPAC-1细胞。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡；酶化学法检测caspase活性；RT-PCR及蛋白质印迹法检测凋亡相关基因的表达。结果斑蝥素呈剂量依赖性明显抑制胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1增殖及诱导细胞凋亡。10 μmol/L斑蝥素处理细胞72 h，PANC1、CFPAC-1细胞的增殖抑制率最高，分别达(52.95±6.34)%和(71.21±6.30)%。处理24 h，PANC1细胞的早期和晚期凋亡细胞分别从7.35%增加到24.89%、6.36%增加到17.73%；CFPAC-1细胞从6.39%增加到24.70%、9.21%增加到12.58%(P值均<0.01)。PANC1细胞的caspase 8和caspase 9 活性分别为对照组的(155.8±11.5)%和(194.6±14.7)%；CFPAC-1细胞分别为对照组的(182.5±24.3)%和(215.8±12.2)%(P值均<0.01)。促凋亡基因TNF-α、TRAILR1、TRAILR2、Bad、Bak和Bid表达增加，抗凋亡基因Bcl-2表达减少。结论斑蝥素通过激活Caspase、上调促凋亡基因及下调抗凋亡基因的表达从而诱导胰腺癌细胞凋亡。

胰腺肿瘤； 斑蝥素； 细胞凋亡

近年来研究发现，传统中药斑蝥的有效成分斑蝥素[1]及其衍生物对包括白血病[2]、肝癌[3]、结肠癌[4]等诸多肿瘤细胞具有显著抑制作用。临床上，斑蝥素在治疗癌症，特别是晚期肝癌方面显示出其独特的疗效[5]。因此斑蝥素有可能应用于胰腺癌，特别是晚期胰腺癌的治疗。本实验观察斑蝥素对胰腺癌细胞凋亡的诱导作用，探讨其分子机制。

材料与方法

一、MTT比色法检测细胞活力

胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1购自TCC公司，常规培养、传代。取对数生长期的胰腺癌细胞接种于96孔板，每孔0.5×104个细胞。培养24 h后分别加入含0、2、4、6、8、10 μmol/L斑蝥素(Biomol公司)处理24、48、72 h，每孔加入5 mg/ml的MTT(Sigma公司)10 μl，37℃孵育4 h，弃培养液，加150 μl DMSO，震荡至紫色结晶完全消失。用全自动酶标仪测定各孔490 nm处吸光度(A)值。细胞生长抑制率=[(对照组A490值-处理组A490值)/对照组A490值]×100%。半数抑制浓度(IC50)= lg-1[Xk-i (∑p-0.5)]。Xk为设计的最大浓度对数值；i为倍比浓度的对数值；∑p为各组细胞生长抑制率之和；0.5为经验常数。

二、流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期胰腺癌细胞接种于6 cm培养皿培养24 h，应用0、3、6 μmol/L斑蝥素处理24 h，胰酶消化，收集细胞，采用KeyGen公司的凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。按说明书操作。最后上流式细胞仪检测。

三、细胞caspase 8、caspase 9活性检测

应用0、10 μmol/L斑蝥素处理细胞24 h，收集细胞，采用caspase 8、caspase 9活性检测试剂盒(Beyotime公司)测定caspase活性，按说明书操作。用全自动酶标仪测定各孔A405值。 caspase相对活性=(处理组A405值/对照组A405值)×100 %。

四、凋亡调控相关基因表达的检测

以10 μmol/L斑蝥素分别处理胰腺癌细胞0、1.5、3、6、12、24 h，采用Trizol提取细胞总RNA。用AMV反转录试剂盒(Promega公司)进行反转录。凋亡调控相关基因的引物序列见表1。RT-PCR法检测各基因的mRNA表达。

表1 凋亡调控相关基因及所使用的引物序列

收集处理0、6、12、24 h细胞，用冰预冷的细胞裂解液550 mmol/L Tris-HCl[(pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100、0.1% SDS、1 mmol/L EDTA及蛋白酶抑制剂10 mg/ml leupeptin、10 mg/ml aprotinin、10 mg/ml pepstatin A、1 mmol/L 4-(2-aminoe-thyl) benzenesulfonyl fluoride]裂解细胞，常规蛋白质印迹法检测凋亡调控相关基因的蛋白表达。抗Bcl-2抗体购自Cell Signaling Technology公司，抗Bad、Bak、TNF-α、TRAILR1、TRAILR2、β-actin抗体均购自Sanda Cruz Biotechnology公司。抗β-actin抗体1∶5000稀释，其余抗体均1∶500稀释。最后ECL发光。

五、统计学处理

用SPSS10.0统计学软件进行分析，不同处理组之间的差异采用成组t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、胰腺癌细胞生长抑制率的变化

斑蝥素呈剂量和时间依赖性明显抑制胰腺癌细胞的生长(表2)。

表2 斑蝥素对胰腺癌PANC1、CFPAC-1细胞的生长抑制率

注：同一细胞系内与24 h点及2 μmol/L浓度组比较，aP<0.05，bP<0.01

二、胰腺癌细胞凋亡率的变化

斑蝥素处理胰腺癌细胞系24 h，早期和晚期凋亡细胞比例呈剂量依赖性增加(图1)。

图1 斑蝥素干预后胰腺癌细胞系的凋亡细胞

三、细胞caspase 8和caspase 9活性的变化

10 μmol/L斑蝥素处理胰腺癌细胞24 h，PANC1细胞的caspase 8和caspase 9活性分别为对照组的(155.8±11.5)%和(194.6±14.7)%；CFPAC-1细胞分别为对照组的(182.5±24.3)%和(215.8±12.2)%，均显著增加(P值均<0.01)。

四、细胞凋亡相关基因表达的变化

斑蝥素处理后，参与外源性凋亡通路的TNF-α、TRAILR1(DR4)和TRAILR2(DR5)的mRNA和蛋白表达水平均增加；参与内源性凋亡通路的促凋亡基因Bad、Bak、Bid的mRNA和蛋白表达水平均增加；而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均降低(图2)。

讨 论

Caspase家族介导凋亡信号转导[6]，主要通过caspase 8介导的外源性凋亡通路(即死亡受体途径)和caspase 9介导的内源性凋亡通路(即线粒体途径)[6]。

当胞外死亡配体与细胞表面的受体结合，可激活外源性凋亡通路[6]，使参与外源性凋亡通路的诸多配体和受体，如TNF-α、TRAIL1和TRAIL2等的表达明显上调，其中TNF-α是胰腺癌细胞凋亡诱导因子[7]。在特定的凋亡刺激下，线粒体内膜的一些蛋白被释放到胞质中，从而激活内源性凋亡途径[8]。这些蛋白主要是Bcl-2家族成员[8]。

图2 细胞凋亡相关基因的mRNA(a、b)及蛋白(c)表达

本实验结果显示，斑蝥素处理后，PANC1和CFPAC-1的凋亡细胞比例明显增加，同时caspase 8和caspase 9均被激活，TNF-α、TRAILR1、TRAILR2的mRNA和蛋白表达水平均增加，促凋亡基因Bad、Bak、Bid的mRNA和蛋白表达水平也增加，而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平降低，提示外源性和内源性凋亡通路均参与了斑蝥素诱导的胰腺癌细胞凋亡过程，且可能存在一定的交叉。

PANC1和CFPAC-1的TRAIL1和TRAIL2表达水平很低，因此对TRAIL诱导的凋亡很不敏感[9-10]，

这可能是胰腺癌对化疗不敏感的原因之一。斑蝥素处理后，虽然TRAIL的表达没有明显改变，但TRAIL1和TRAIL2的表达显著增加，从而增加了胰腺癌细胞对TRAIL诱导的凋亡的敏感性，提示斑蝥素有可能会增强其他化疗药物的治疗效果，有可能为胰腺癌的治疗带来新的希望。

[1] Wang GS.Medical uses of mylabris in ancient China and recent studies.J Ethnopharmacol,1989,26:147-162.

[2] Huh JE,Kang KS,Chae C,et al.Roles of p38 and JNK mitogen-activated protein kinase pathways during cantharidin-induced apoptosis in U937 cells.Biochem Pharmacol,2004,67:1811-1818.

[3] Chen YN,Chen JC,Yin SC,et al.Effector mechanisms of norcantharidin-induced mitotic arrest and apoptosis in human hepatoma cells.Int J Cancer,2002,100:158-165.

[4] Peng F,Wei YQ,Tian L,et al. Induction of apoptosis by norcantharidin in human colorectal carcinoma cell lines:involvement of the CD95 receptor/ligand.J Cancer Res Clin Oncol,2002,128:223-230.

[5] Ma T,Zhu ZG,Ji YB,et al.Correlation of thymidylate synthase,thymidine phosphoylate and dithydropyrimidine dehydrogenase with sensitivity of gastrointestiral concer cells to 5-fluoroural and 5-flooro-2′-deoxyuridine.World J Gastroenterol,2004,10:172-176.

[6] Riedl SJ,Shi Y.Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis.Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5:897-907.

[7] Kondo J,Sato F,Kusumi T,et al.Claudin-1 expression is induced by tumor necrosis factor-alpha in human pancreatic cancer cells.Int J Mol Med,2008,22:645-649.

[8] Youle RJ,Strasser A.The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death.Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9:47-59.

[9] Hesry V,Piquet-Pellorce C,Travert M,et al.Sensitivity of prostate cells to TRAIL-induced apoptosis increases with tumor progression:DR5 and caspase 8 are key players.Prostate,2006,66:987-995.

[10] Mori T,Doi R,Toyoda E,et al.Regulation of the resistance to TRAIL-induced apoptosis as a new strategy for pancreatic cancer.Surgery,2005,138:71-77.

2010-08-11)

(本文编辑：吕芳萍)

CantharidininducesapoptosisinpancreaticcancercelllinesPANC1andCFPAC-1

LIWei,CHENZheng,ZONGYang,GONGFei-ran,ZHUYi,YINHong,XUZe-kuan,TAOmin,MIAOYi.

DepartmentofOncology,FirstAffiliatedHospital,SoochowUniversity,Suzhou215006,China

XUZe-kuan,Email:xuzekuan@njmu.edu.cn；TAOmin,Email:mtao@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the apoptosis induction effect of Cantharidin on pancreatic cancer cell line PANC1 and CFPAC-1 and possible mechanism.MethodsPANC1 and CFPAC-1 was treated with Cantharidin. Cell growth was determined by MTT. Apoptosis was measured by flow cytometry. Caspase activity was measured by using enzyme chemical method. Apoptosis-related gene expressions were determined by using RT-PCR and Western blotting.ResultsCantharidin significantly inhibited the growth of pancreatic cancer cells PANC1, CFPAC-1 and induced apoptosis in a dose-dependent manner. Seventy-two hours after 10 μmol/L Cantharidin treatment, the inhibitory rates of PANC1, CFPAC-1 were (52.95±6.34)% and (71.21±6.30)%. Twenty-four hours after treatment, the early and later period apoptotic cell of PANC1 was increased from 7.35% to 24.89%, from 6.36% to 17.73%. The early and later period apoptotic cell of CFPAC was increased from 6.39% to 24.70%, from 9.21% to 12.58%(P<0.01). Activity of caspase 8 and caspase 9 in PANC1 cells was (155.8±11.5)% and (194.6±14.7)% when compared with that of control group. Activity of caspase 8 and caspase 9 in CFPAC-1 was (182.5±24.3)% and (215.8±12.2)% when compared with that of control group (P<0.01). The expression of pro-apoptotic genes, TNF-α, TRAILR1, TRAILR2, Bad, Bak and Bid was elevated, the expression of anti-apoptotic Bcl-2 gene was decreased.ConclusionsCantharidin can induce apoptosis in pancreatic cancer cell lines by activating caspase,up-regulating the expression of pro-apoptotic genes and down-regulating the expression of anti-apoptotic genes.

Pancreatic neoplasms; Cantharidin; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.008

国家自然科学基金(30872509)；江苏省“六大人才高峰”项目[2007200(EI07)]

215006 苏州，苏州大学附属第一医院肿瘤科(李伟、殷红、陶敏)，血液科(龚斐然)；南京医科大学第一附属医院普外科(李伟、陈政、宗洋、朱毅、徐泽宽、苗毅)

徐泽宽，Email:xuzekuan@njmu.edu.cn；陶敏，Email: mtao@medmail.com.cn