建立牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液的细菌内毒素检查法

王宗春，周延安，张 洪

(武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060)

建立牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液的细菌内毒素检查法

王宗春，周延安，张 洪

(武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060)

目的建立牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液的细菌内毒素检查法。方法按照中国药典2010年版(二部)附录Ⅺ E细菌内毒素检查法进行干扰试验。结果牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液经100倍稀释后，用灵敏度λ为0.5 EU/ml的鲎试剂进行实验，供试品不干扰细菌内毒素检查。结论建立的牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液细菌内毒素检查可行。

细菌内毒素; 鲎试剂; 牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液; 干扰试验

牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液为无色至淡黄色的水性澄明溶液，临床适用于颈、肩、腕综合症及腰痛症病人的病痛、冷感、麻木等症状的缓解，另外也可用于治疗症状性神经痛等。牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液暂未收入中国药典，也尚无国家标准，其企业注册标准中采用热原检查法(家兔法)控制热原，但家兔法存在试验条件要求较高、操作繁琐和影响因素较多等缺点，而细菌内毒素检查法具有灵敏快速、简便易行及重现性好等优点，已被各国药典所采用，目前尚未有牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液细菌内毒素检查法的报道，笔者参照中国药典细菌内毒素检查法[1]以及《中国药品检验标准操作规范》2005年版[2]，对本品进行了细菌内毒素检查法的可行性研究。

1 实验材料

牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液(威世药业有限公司，规格3 ml，批号20091007-1，20091103-2，20091209-1)；细菌内毒素检查用水(BET水，厦门鲎试剂实验厂，规格50 ml，批号091107)；细菌内毒素工作标准品(中国生物制品检定所，规格10 EU，批号2009-7)；鲎试剂(TAL，厦门鲎试剂实验厂，规格0.1 ml，批号091149，标示灵敏度0.5 EU/ml)；鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，规格0.1 ml，批号090325，标示灵敏度0.5 EU/ml)；恒温水浴箱(江苏南通嘉程仪器有限公司)；微量取液器(50～250 μl)(上海金林生化试剂仪器厂)；SW-80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；细菌内毒素检查用具(厦门鲎试剂实验厂)。

2 方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度复核 按《中国药典》2010年版二部附录XI E细菌内毒素检查法[1]进行操作，结果表明两个批号的鲎试剂灵敏度测定值λc均在0.5λ～2.0λ之间，符合规定，可用于实验。

2.2细菌内毒素限值(L)的确定 细菌内毒素限值L =K/M[1]，式中K为人每千克体重每小时最大可接受的细菌内毒素剂量，注射剂为5 EU/(kg·h)；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，按照牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液说明书用法用量，M为0.05 ml/(kg·h)，求得L=K/M=100 EU/ml。考虑到牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液成分较为复杂，为严格质量标准，将本品的细菌内毒素限值L定为50 EU/ml为宜。

2.3样品最大有效稀释倍数(MVD)的确定 样品最大有效稀释倍数MVD= L/λ，其中L为细菌内毒素限值(50 EU/ml)，λ为鲎试剂灵敏度，本试验中λ为 0.5 EU/ml，对应的样品MVD为100，即稀释倍数不超过100倍的供试品溶液均可用于干扰试验。

2.4干扰预试验[3，4]用BET水将牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液稀释至20、40、80、100倍的系列溶液，与原液一起作为供试品阴性对照(NPC)系列，测定pH值，均在6.5～7.0范围内。另制备同样倍数的供试品系列溶液，使每一稀释度的供试品溶液中都含有2 λ(λ为0.5 EU/ml)细菌内毒素，作为供试品阳性对照(PPC)系列。每一供试品浓度重复两管，按常规设立阳性对照(PC)管和阴性对照(NC)管。用λ为0.5 EU/ml的鲎试剂与上述系列溶液进行反应，结果见表1，可以看出原液对鲎试剂与细菌内毒素之间的凝集反应有抑制作用，20倍或更大倍数稀释液不干扰细菌内毒素检查。

表1 干扰预试验结果

2.5干扰试验 根据干扰预试验结果，用供试品100倍稀释溶液及BET水分别稀释细菌内毒素工作标准品，配成细菌内毒素最终浓度分别为1.0、0.5、0.25、0.125 EU/ml的系列溶液，分别取0.1 ml加入到已复溶的两个不同厂家生产的鲎试剂(λ为0.5 EU/ml)管内，每个浓度平行做4管，另取供试品溶液做2支阴性对照管，进行干扰试验，结果见表2，Et/ Es在0.5～2之间(Es为用BET水制成的细菌内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值，Et为用供试品溶液制成的内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值)，按照中国药典2010年版(二部)判断标准，供试品100倍稀释溶液对鲎试剂与细菌内毒素之间的凝集反应无干扰，可以使用鲎试剂方法检查牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液中细菌内毒素。

表2 100倍样品稀释溶液干扰试验结果

2.6家兔法与细菌内毒素检查法对比研究 取3批经家兔法检查合格的牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液，配制成100倍稀释溶液，使用两个厂家生产的鲎试剂(灵敏度λ均为0.5 EU/ml)，按中国药典2010年版(二部)附录细菌内毒素检查法检查，结果全部符合规定，详见表3。

表3 供试品家兔法与细菌内毒素检查法检查结果

3 讨论

细菌内毒素检查法中要求供试溶液的pH值在6.0～8.0范围内，过酸、过碱的供试品需调节其pH值。因此，在试验中用pH计测定了样品原液及20、40、80、100倍系列溶液的pH值，结果均在6.5～7.0之间，不需调整，可直接用于细菌内毒素检查。

本试验可以将样品稀释至100倍直接进行干扰试验，为了掌握样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质，对样品原液及20、40、80、100倍系列溶液进行了干扰预试验，结果表明只有样品原液干扰细菌内毒素检查。由表2干扰试验结果可以看出，3批样品经稀释100倍后，分别使用两个不同厂家生产的鲎试剂(灵敏度均为0.5 EU/ml)进行干扰试验，其Et/Es均在0.5～2.0范围内，确认样品在该稀释倍数下不干扰细菌内毒素检查。根据实验结果，确定牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液细菌内毒素检查方法如下：将本品稀释100倍，依照中国药典2010年版(二部)附录细菌内毒素检查法进行检查，细菌内毒素限值定为50 EU/ml。

[1] 中国药典2010版. 二部[S]. 2010. 附录99.

[2] 中国药品生物制品检定所. 中国药品检验标准操作规范[M]. 北京: 中国医药科技出版社，2005: 287.

[3] 高 锦，付 聪，嵇 扬，等. 复方氯解磷定注射液细菌内毒素的检查方法[J]. 药学实践杂志，2008，26(2)：133.

[4] 胡宇驰，杨赟昀，朱春玥，等. 醋酸戈舍瑞林缓释植入剂细菌内毒素检查方法学研究[J]. 药学实践杂志，2010，28(1)：36.

2010-08-12

[修回日期]2010-11-21

Establishmentofbacterialendotoxinstestinextractsinjectionfromrabbitskininflamedbyvacciniavirus

WANG Zong-chun, ZHOU Yan-an, ZHANG Hong

(Department of Pharmacy, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,China)

ObjectiveTo establish a method for the detection of bacterial endotoxin in extracts injection from rabbit skin inflamed by vaccinia virus.MethodsThe interference test was carried out according to the guideline and procedure specified in appendix Ⅺ E, volume two, chinese pharmacopoeia 2010 edition.ResultsBy using tachypleus amebocyte lysates which sensitivity was 0.5 EU/ml, the sample did not interfere with the bacterial endotoxins test when it was diluted 100 times.ConclusionThe established method of bacterial endotoxins test for extracts injection from rabbit skin inflamed by vaccinia virus was feasible.

bacterial endotoxins；tachypleus amebocyte lysate；extracts injection from rabbit skin inflamed by vaccinia virus ;the interference test

王宗春(1967-)，男，副主任药师. E-mail:w-zongchun@163.com.

R927.12

A

1006-0111(2011)02-0128-03