转Bt-cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫解毒酶和中肠蛋白酶活性的影响

崔 蕾， 王振营， 何康来， 白树雄

中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

转Bt-cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫解毒酶和中肠蛋白酶活性的影响

崔 蕾， 王振营， 何康来， 白树雄

中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

研究了取食转Bt-cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫Propylaeajaponica(Thunberg)体内解毒酶和中肠蛋白酶活性的影响。利用饲喂结合比色方法，比较龟纹瓢虫取食转Bt-cry1Ah基因玉米花粉和非转基因玉米花粉后体内α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的酶活性。结果发现：在解毒酶方面，取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫4龄幼虫和蛹的α-乙酸萘酯酶活性显著低于取食非Bt玉米花粉的龟纹瓢虫(对照组)，取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性在各个发育时期与对照相比均无显著差异。在中肠蛋白酶方面，与对照组相比，取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的总蛋白酶和强碱性类胰蛋白酶活性在各个发育时期均无显著差异；但取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的弱碱性类胰凝蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性在蛹期显著低于取食非Bt玉米花粉的龟纹瓢虫。由此可见，龟纹瓢虫取食含有Cry1Ah杀虫蛋白的玉米花粉后,体内代谢解毒酶和中肠蛋白酶与Cry1Ah杀虫蛋白相互作用，可能会引起某些酶活性的变化。因此，转cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫的潜在影响还需要进一步的研究。

转Bt-cry1Ah基因玉米； 花粉； 龟纹瓢虫； 解毒酶； 中肠蛋白酶； 酶活性

随着转基因技术的飞速发展以及转基因玉米的大面积推广，转基因玉米在带来巨大的社会、经济和生态效益的同时，其安全性问题也引起了世界范围内的广泛关注(Berglsonetal.,1998; Crawleyetal.,2001; Conneretal.,2003; Hancock,2003)。自Loseyetal.(1999)报道了转基因玉米花粉对非靶标昆虫帝王斑蝶Danausplexippus生长发育有不利影响之后，转基因植物对非靶标昆虫潜在的影响倍受重视。非靶标害虫玉米跳虫Chaetocnemapulicar、日本丽金龟Popilliajaponica和十一星根萤叶甲Diabroticaundecimpunctata取食表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt玉米后，体内都含有相当数量的Cry1Ab杀虫蛋白(Harwoodetal.,2005)。绿草蛉Chrysoperlacarnea取食添加雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin,GNA)的人工饲料后，成虫的寿命未受到影响，但GNA的聚集会对其产卵前期、日产卵量和总产卵量产生负面的影响；用添加了GNA的人工饲料饲喂的草蛉幼虫羽化后成虫的体重、产卵前期、日产卵量和总产卵量没有区别，但卵的孵化率则显著减少，所以浓度较高的GNA会对草蛉造成一些不利的影响(Li amp; Romeis,2009)。将转cry1Ab基因玉米花粉、纯化的Cry1Ab蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)分别拌入糖浆饲喂蜜蜂成虫，结果表明,取食花粉、Cry1Ab蛋白的蜜蜂存活率和下咽腺的生长发育均无明显差异，而取食SBTI的蜜蜂下咽腺管的平均重量、平均直径显著降低(Babendreieretal.,2005)。

Bt-cry1Ah基因是从我国苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)分离株BT8中克隆鉴定的新型杀虫蛋白基因，其编码的蛋白对亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis、棉铃虫Helicoverpaarmigera和水稻二化螟Chilosupperssalis等有很强的杀虫活性(Xueetal.,2008)。我国已经将优化的Bt-cry1Ah基因活性片段转入玉米，获得了遗传稳定的转Bt-cry1Ah基因抗虫玉米，并证明表达该基因的玉米对玉米螟有显著抗性(Wangetal.,2008;岳同卿等,2010)。瓢虫有取食花粉的习性(Woldetal., 2001)，由于玉米散粉期有大量的花粉沉积在植株叶腋处，而瓢虫等捕食性天敌常在叶腋处活动，这增加了瓢虫接触到杀虫蛋白的风险(邢珍娟等，2008)。研究表明，转cry1Ab基因玉米花粉对斑鞘饰瓢虫Coleomegillamaculata和异色瓢虫Harmoniaaxyridis的生长发育和产卵情况等没有不利的影响(Lundgren amp; Wiedenmann,2002;张永军等,2005)，但是否对龟纹瓢虫Propylaeajaponica的生理代谢有影响，尚未见报道。本试验研究转Bt-cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫体内解毒酶和中肠蛋白酶活性的影响，以期为转基因抗虫玉米的环境安全性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试玉米花粉

转Bt-cry1Ah基因玉米(以下简称Bt玉米)及其亲本X090(以下简称非Bt玉米)由中国农业科学院生物技术研究所提供。玉米种植于中国农业科学院廊坊试验基地农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京)试验地。散粉前在玉米雄穗上套上授粉袋，分别收集Bt玉米和非Bt玉米花粉，迅速带回实验室，将花粉转移到密封塑料袋中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 供试昆虫及饲养方法

龟纹瓢虫由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所提供，麦长管蚜Sitobionavenae由中国农业科学院植物保护研究所小麦害虫组提供。瓢虫饲养在塑料养虫笼(30 cm×25 cm×30 cm)中，置于光照培养箱(温度25 ℃，RH60%～70%，L∶D=16∶8)待产卵。麦长管蚜饲养在小麦苗上，并置于光照培养箱(温度23 ℃，RH60%～70%，L∶D=16∶8)中。待瓢虫卵孵化后，将初孵的龟纹瓢虫幼虫单头饲养在塑料培养皿(6 cm×6 cm)内，置于光照培养箱中，培养皿中放清洁保湿棉球，每天更换1次。瓢虫幼虫和成虫每天饲喂足量的蚜虫1次。

1.3 瓢虫体内代谢解毒酶活性测定

1.3.1 酶提取液的制备 每24头初孵瓢虫幼虫为1组，共10组。其中，5组用Bt玉米花粉与蚜虫按2∶1(重量比)混合喂养，作为处理组；5组用非Bt玉米花粉与蚜虫按2∶1混合喂养，作为对照组。分别取瓢虫2、3、4龄幼虫，蛹和羽化后第10 d的成虫虫体各8头，放入玻璃匀浆器中，加入500 μL pH 8.0的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(含0.1% TritonX-100)，冰浴匀浆，匀浆液在4 ℃、12000×g离心机上离心30 min，取上清液作为酶提取液。每个处理重复3次。

1.3.2 α-乙酸萘酯酶活性测定 测定方法参照van Asperen (1962)并加以改进。反应混合液中含有10 μL酶液、90 μL 0.04 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)、50 μL 0.0004 mol·L-1α-乙酸萘酯液。在37 ℃水浴中保温30 min,加入50 μL显色剂(1%固牢蓝B盐与SDS溶液按2∶5混合)，室温下放置10 min, 置于酶标仪(Bio-Rad公司，Microplate Reader550)中，在600 nm处比色，测其D值。设定每15 s记录1次D值，共记录30次。

1.3.3 乙酰胆碱酯酶活性测定 测定方法参照Ellman (1961)并加以改进。取10 μL酶液、90 μL 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 8.0)、20 μL 0.075 mol·L-1碘化乙酰胆碱、30 μL 0.01 mol·L-1DTNB液，在25 ℃水浴中保温15 min，加入50 μL 0.01 mol·L-1毒扁豆碱，置于酶标仪中，在410 nm处比色，测其D值。记录方式同1.3.2。

1.3.4 谷胱甘肽-S-转移酶活性测定 测定方法参照Booth (1961)并加以改进。反应混合液中含有10 μL酶液、90 μL 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 8.0)、50 μL 0.03 mol·L-1谷胱甘肽液、50 μL 0.1 mol·L-1CDNB液。在25 ℃水浴中反应30 min，加热使其失活，置于酶标仪中，在340 nm处比色，测其D值。记录方式同1.3.2。

1.4 主要中肠蛋白酶活性测定

测定方法参照王琛柱和钦俊德(1996)并加以改进。

1.4.1 中肠酶液的制备 每24头初孵瓢虫幼虫为1组，共10组，试虫同1.3.1。分别取瓢虫2、3、4龄幼虫，蛹和羽化后第10 d的成虫虫体各8头，放入玻璃匀浆器中，加入预冷的0.15 mol·L-1氯化钠后，冰浴匀浆，然后将匀浆液转入离心管离心15 min (4 ℃，12000×g)，取上清液作为酶液，-20 ℃贮存备用。

1.4.2 中肠总蛋白酶活性测定 将20 mg·mL-1偶氮酪蛋白溶于0.15 mol·L-1氯化钠中，取40 μL该液加入5 μL酶液及20 μL 0.2 mol·L-1甘氨酸—氢氧化钠(pH 10.0),整个反应体系于30 ℃育温2 h,然后加入预冷的10%(V/V)三氯乙酸65 μL终止反应。最后于12000×g离心15 min，取上清液60 μL及40 μL 1 mol·L-1氢氧化钠置于酶标仪中，于405 nm处测定D值。记录方式同1.3.2。

1.4.3 类胰蛋白酶活性测定 (1)强碱性类胰蛋白酶。以BAPNA作为底物，将20 mg·mL-1BAPNA溶于二甲基亚砜，取45 μL该液加入90 μL 0.1 mol·L-1甘氨酸—氢氧化钠(pH 10.0)和5 μL酶液后立即置于酶标仪中，于405 nm处测其D值。(2)弱碱性类胰蛋白酶。以TAME作为底物，将2 mmol·L-1TAME溶于0.15 mol·L-1氯化钠中，取45 μL该液加入90 μL Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和5 μL酶液后立即置于酶标仪中，于248 nm处测定D值。记录方式同1.3.2。

1.4.4 类胰凝乳蛋白酶活性测定 以BTEE作为底物，将1 mmol·L-1BTEE溶于含10%(V/V)甲醇的0.15 mol·L-1氯化钠溶液中，取50 μL该液加入45 μL 0.2 mol·L-1Tris-HCl溶液(pH8.5)和5 μL酶液后置于酶标仪中，在256 nm处测D值。记录方式同1.3.2。

1.5 酶活性的计算

酶活性的计算参照印芳等(2008)。

酶活性=(△D×VT)/(W×VS×0.01×t)

其中,△D为1.3和1.4中不同波长下，反应时间内D的变化；VT为酶液总体积/mL；W为试验材料鲜重/g；VS为测定时所取的酶液体积/mL；t为反应时间/min。酶活性单位为U· g-1· min-1。

1.6 数据处理

采用SPSS11.5软件对试验数据进行方差分析，差异显著性(Plt;0.05)比较采用独立样本t测验。

2 结果与分析

2.1瓢虫取食Bt玉米花粉时体内主要代谢解毒酶活性的变化

从表1可以看出，取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的α-乙酸萘酯酶活性在4龄幼虫和蛹期与对照组相比显著降低，而在2、3龄幼虫和成虫期与对照相比均无显著差异。取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性在各个发育时期与对照相比均无显著差异。

2.2瓢虫取食Bt玉米花粉时中肠蛋白酶活性的变化

从表2可以看出，与对照组相比，取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的总蛋白酶和强碱性类胰蛋白酶活性在各个发育时期均无显著差异。但取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性在蛹期与对照组相比显著降低，而在2、3、4龄幼虫和成虫期与对照组相比则无显著差异。

表1 瓢虫取食Bt玉米花粉和非Bt玉米花粉的主要代谢解毒酶活性比较

数据为平均值±标准误，同行数据后附*表示差异显著(Plt;0.05)。
Data in the lable are means±1S.E.,and those in the same row followed by * show significant difference atPlt;0.05.

表2 瓢虫取食Bt玉米花粉和非Bt玉米花粉的中肠蛋白酶活性比较

数据为平均值±标准误，同行数据后附*表示差异显著(Plt;0.05)。
Data in the lable are means±1S.E.,and those in the same row followed by * show significant difference atPlt;0.05.

3 讨论

有关转基因植物对龟纹瓢虫生长等方面影响的研究较多。李丽莉(2004)研究表明，龟纹瓢虫取食在Bt玉米上繁殖的玉米蚜Rhopalosiphummaidis和表达CrylAb杀虫蛋白的玉米花粉后未受到影响。Baietal.(2005)研究发现，取食转cry1Ab基因水稻KMD1系花粉的龟纹瓢虫雌成虫寿命显著低于取食亲本花粉的龟纹瓢虫，在KMD2系中新羽化的雄成虫活性显著低于亲本；但两者间的生长发育、存活和繁殖并无显著差异。龟纹瓢虫捕食了表达Cry1Ac蛋白转基因抗虫棉花上的棉铃虫后只是体重和体长减小，幼虫的存活率、生长发育、死亡率、产卵和成虫寿命都未受到影响(Zhangetal.,2006)。此外，捕食性瓢虫可能会通过取食转基因植物田中的害虫而摄入Bt杀虫蛋白(Obristetal.,2006)。还有研究表明，转cry1Ac/cry1Ab基因棉花对龟纹瓢虫幼虫没有直接的不利影响(Zhangetal.,2006)。

本研究结果表明，Bt玉米花粉对龟纹瓢虫体内代谢解毒酶和中肠蛋白酶活性有一定的影响。取食转Bt-cry1Ah基因玉米花粉的龟纹瓢虫的α-乙酸萘酯酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性在蛹期显著低于取食非Bt玉米花粉的龟纹瓢虫，说明瓢虫体内代谢解毒酶和中肠蛋白酶在与Bt杀虫蛋白相互作用时可能会引起某些酶活性的变化，但个别酶活性的变化还不足以影响瓢虫的生长发育。本试验结果与表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt玉米花粉对异色瓢虫体内解毒代谢酶的影响(张永军等，2005)相似。用表达Cry1Ac杀虫蛋白的Bt棉花粉饲喂意大利蜜蜂Apismellifera后，蜜蜂体内代谢酶和一些消化酶的变化也未对其生长发育造成不利的影响(田岩等,2006)。有关转Bt-cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫的潜在影响还需进一步研究。

李丽莉.2004.转Bt基因玉米对玉米蚜及其捕食性天敌龟纹瓢虫的影响.陕西:西北农林科技大学.

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EffectsoftransgenicBt-cry1Ahmaize(ZeamaysL.)pollenontheactivityofdetoxificationenzymesandmidgutproteaseinPropylaeajaponica(Thunberg) (Coleoptera:Coccinellidae)

Lei CUI, Zhen-ying WANG, Kang-lai HE, Shu-xiong BAI

StateKeyLaboratoryfortheBiologyofthePlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193，China

The experiments were conducted in laboratory to explore the effects of transgenic. The activtiy changes of detoxification enzymes and midgut protease after feeding on the pollen of transgenicBt(Bt-cry1Ah) maize in the ladybird beetlePropylaeajaponica(Thunberg) was examined. The activities of the α-naphthylacetate esterase， acetylcholinesterase, glutathione-S-transferase, total protease, alkaline trysin-like proteinase and chymotrypsin-like proteinase in beetles rearedBtand non-Btmaize pollen were compared by feeding the on transgenicBt-cry1Ah maize pollen combinded with colorimetric method. The results indicated that there were no differences in the activities of acetylcholinesterase, glutathione-S-transferase, total protease and active alkaline trysin-like proteinase inP.japonicain any examined larval instars of larvae and adults fed on transgenicBtmaize pollen vs. those fed on nonBtpollen (the control). The activity levels of α-naphthylacetate esterase in 4th instar larvae and pupae, and the weak alkaline trysin-like proteinase and chymotrypsin-like proteinase inP.japonicaat pupae fed on transgenicBtmaize pollen were significantly lower in beetles feeding on transgenic pollen than that in the control. Therefore, the interation of the detoxification enzymes and midgut proteases and Cry1Ah protein may cause some of the enzymes activities. The potential impact of transgenicBt-cry1Ah maize pollen onP.japonicaneed to futher study.

transgenicBt-cry1Ah maize; pollen;Propylaeajaponica; detoxification enzyme; midgut protease; enzyme activity

2011-01-10接受日期2011-01-25

转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08011-003)

王振营,E-mail：zywang@ippcaas.cn