西花蓟马检测鉴定技术研究进展

张桂芬 ，孟祥钦 ，万方浩中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193;农业部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京100081

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripidae)花蓟马属的一种昆虫，为美国和加拿大西部洛基山脉常见的一种重要害虫，最早记载于1895年(Beshear，1983)。近30年来，随着全球经济一体化进程的加快和国际贸易活动的日趋频繁，西花蓟马迅速传播扩散，已经在北美、欧洲、亚洲、南美、非洲和大洋洲的许多国家建立种群，并暴发成灾(Kirk＆Terry，2003)。为此，我国农业部于1996年将西花蓟马列为进境植物检疫潜在的危险性害虫。目前已命名的蓟马种类有5500余种(Mound＆Morris，2004)，其中，我国的蓟马种类约300种，分属104属(韩运发，1997;张友军等，2003;魏书军等，2010)。其入侵我国的历史较短，2000年在昆明国际花卉节参展的缅甸盆景上被首次截获(蒋小龙等，2001);2003年在北京温室的辣椒上被发现(张友军等，2003);之后在云南(徐家菊和韦丽莉，2005)、山东(郑长英等，2007)等地陆续发生危害。

西花蓟马为多食性害虫，可以在包括菊科、葫芦科、茄科、豆科、十字花科等在内的60多个科500多种植物上取食为害(Yudin et al.，1986;Moritz，2002)。西花蓟马的危害方式主要有2种:(1)产卵为害或以锉吸式口器取食为害，不仅降低产量，使花卉丧失观赏价值，而且严重影响果实的品质(Robb ＆ Parrella，1989;Cockfield et al.，2007);(2)传播植物病毒，如番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)(Gardener et al.，1935)、凤仙斑点坏死病毒(impatiens necrotic spot virus，INSV)(Deangelis et al.，1993;Wijkamp ＆ Peters，1993)、花生环斑病毒(groundnut ringspot virus，GRSV)、番茄褪绿斑点病毒(tomato chlorotic spot virus，TCSV)(Wijkamp et al.，1995)以及菊花茎坏死病毒(chrysanthemum stem necrosis virus，CSNV)(Bezzara et al.，1999)等，使病毒病大流行，造成植物严重减产甚至绝收(Jones，2005)。西花蓟马适生区广泛(程俊峰等，2006;陈洪俊等，2007年)，易造成严重的经济损失。目前仅在我国局部地区发生危害(张友军等，2003、2004;徐家菊和韦丽莉，2005;郑长英等，2007)，但具有进一步扩散蔓延的趋势，快速准确的检测鉴定技术是有效遏制其进一步发生危害的首要条件。因此，本文概述了西花蓟马检测鉴定技术研究进展。

1 传统的形态学鉴定法

传统的形态学鉴定法直观且成本低，因此在西花蓟马的识别中发挥了巨大作用。如雷仲仁等(2004)根据单眼鬃和复眼后最长鬃的长度比较、后胸盾片感觉器的有无、腹部第8节背板后缘梳毛是否完整和寄主植物范围等，将西花蓟马与其近缘种花蓟马F.intonsa(Trybom)和禾花蓟马F.tenuicornis(Uzel)进行了区分。张维球和曾玲(2004)编制了鉴定检索表，用于区分我国报道的棉花蓟马F.gossypii(Shirak)、花蓟马、百合花蓟马F.lilivora Kurosawa、柳花蓟马 F.saliscis Moulton、禾花蓟马、威廉斯花蓟马F.williamsi Hood、茭笋花蓟马 F.zizaniophila Han et Zhang，其中，棉花蓟马、百合花蓟马、柳花蓟马、威廉斯花蓟马仅记录于台湾。刘宁等(2005)采用鉴定检索表区分西花蓟马和3种温室蓟马［烟蓟马Thrips tabaci L.、花蓟马、佛罗里达花蓟马 F.bispinosa(Morgan)］。

西花蓟马个体微小，与其他种类的蓟马形态相似，在鉴别时需要专业人员将成虫制成玻片标本，并借助显微镜方可明确其种类(Fedor et al.，2008)。然而，形态学特征的掌握与熟练应用，即使对专门从事蓟马分类的人员而言亦非易事(Gaston＆May，1992)，加之形态学鉴定方法对成虫前的虫态(包括卵、若虫、前蛹、蛹)以及残缺的标本无能为力，因此限制了该方法的广泛应用。但是，与分子生物技术的结合与应用，促进了传统分类学的快速发展(Charles ＆ Godfray，2002)。

2 分子检测鉴定技术

西花蓟马的分子检测鉴定技术主要是根据西花蓟马和其他种类蓟马的靶标DNA序列或蛋白质的差异进行区分(表1)。该技术不受虫态或龄期的限制，且对于残缺的标本也可进行鉴别。与传统的形态学鉴定法相比，分子检测技术结果稳定、灵敏度高、重现性好且简便易行，只需对相关人员进行简单的培训即可完成操作(Darling＆Blum，2007)。目前已有多种分子标记技术用于蓟马的鉴定，主要包括随机多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)标记技术、DNA序列分析法(DNA sequencing)、限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)标记技术、特征序列扩增区域(sequence characterized amplified regions，SCAR)标记技术和实时荧光定量PCR(realtime fluorescent qauantitative PCR，qPCR)检测技术以及蛋白质分析技术［包括单克隆抗体—酶联免疫吸附剂(monoclonal antibodies enzyme-linked immunosorbent assay，Mab-ELISA)检测法和十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)法］等。

表1 用于蓟马鉴别的分子检测技术Table 1 Molecular techniques for identification of thrips species

2.1 RAPD 标记技术

RAPD技术以基因组DNA为靶标，通过选用一系列的简并引物进行PCR扩增及电泳检测得到丰富的带型，然后在比较不同物种带型间差异的基础上进行种类识别。如Bayar et al.(2002)针对6种蓟马以15条RAPD引物获得了103条片段。其中，引物OPB06可用于鉴别花蓟马、豌豆蓟马Kakothrips robustus(Uzel)、间纹蓟马Aeolothrips intermedius Bagnall、Odontothrips confuses Priesner、烟蓟马和Thrips dilatatus Uzel;引物OPD05可区分豌豆蓟马、间纹蓟马、O.confusus和烟蓟马;引物 NO11和OPQ14可有效地区分间纹蓟马和花蓟马;而引物OPA08可用于鉴别间纹蓟马的雌性和雄性。RAPD检测技术简便易行，成本低;但稳定性差，检测结果易受DNA质量、PCR试剂、仪器等因素的影响，因此已逐渐被SCAR标记技术取代(Chakrabarti et al.，2006)。

2.2 DNA序列分析法

昆虫的线粒体基因组 DNA分子比较小，为15.4 ～16.3 kb，含有3 个细胞色素氧化酶亚基基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(mitochondria cytochrome oxidase subunitsⅠ，Ⅱ，Ⅲ;mtDNA COⅠ，mtDNA COⅡ，mtDNA COⅢ)(Flook et al.，1995)，为多拷贝，结构和组织简单且高度保守，母系遗传，缺乏重组，DNA突变率高，进化速率比核DNA快，检测灵敏度高(Hoelzel，1991;Hoy，1994)。因此，在蓟马类昆虫的分子检测鉴定中得到了广泛应用(Brunner et al.，2002;Kox et al.，2005;游中华等，2007;Mainali et al.，2008;Timm et al.，2008)。如游中华等(2007)利用Brunner et al.(2002)设计的简并引物 mtD-7.2F 和mtD-9.2R扩增出包括西花蓟马在内的9种蓟马的COI基因片段(433 bp)，然后通过对PCR产物的直接测序及序列分析，准确地鉴别不同虫态的西花蓟马。此外，线粒体DNA序列分析法所获得的大量的序列信息和一系列的通用引物(Timm et al.，2008)，可用于以后的研究。如 Brunner et al.(2002)根据所选蓟马mtDNA COI基因的碱基序列设计的1对简并引物(mtD-7.2F 和 mtD-9.2R)，曾被许多研究人员采用(Asokan et al.，2007;游中华等，2007;周力兵等，2007)。尽管mtDNA序列分析法需要对PCR扩增产物进行测序及序列分析，但鉴定人员只需具有基本的分子生物学知识和技能，接受简单的培训后便可熟练应用。

2.3 PCR-RFLP 标记技术

PCR-RFLP技术将PCR技术与RFLP技术相结合，通过选取一对引物扩增靶标序列，然后筛选合适的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切图谱计算类群之间的遗传距离，并构建系统发育树，或者直接根据酶切图谱判断是否为靶标类群。RFLP技术可用于鉴别分类地位十分相近的物种，具有快速、灵敏、简便、稳定等特性(Mainali et al.，2008)。PCR-RFLP技术选用的靶标序列通常为核糖体DNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS) 和线粒体 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)。其中，ITS以高拷贝的串联形式存在，进化程度适中(Tautz et al.，1988);而昆虫的 mtDNA较小，基因结构较清楚，用限制性内切酶切割后可直接进行分析(Flook et al.，1995)。如 Mainali et al.(2008)针对西花蓟马和花蓟马细胞色素b基因(cytb)的434 bp片段，选用限制性内切酶Dde I进行酶切，然后通过电泳图谱上的不同带型区分2种蓟马。Rugman et al.(2006)以ITS-1和 ITS-2为靶标，用限制性内切酶Sac II或PspOM I进行酶切，有效地区分 7种硬蓟马属的蓟马。Moritz et al.(2000)以5种内切酶消化西花蓟马和美棘蓟马Echinothrips americanus Motgan的ITS-1和ITS-2片段，通过所产生的不同带型，成功地将2种蓟马区分开。Toda＆Komazaki(2002)通过对包括西花蓟马在内的9种蓟马的ITS-2序列分析，得到适于扩增蓟马ITS片段的特异性引物，并从82种限制性内切酶中筛选出2种内切酶用于鉴别日本果树上常见的 9种蓟马的成虫和若虫。Brunner et al.(2002)根据mtDNA COI扩增产物(433 bp)，结合测序和扩增产物RFLP分析，从12种限制性内切酶中筛选出2种内切酶，构建了系统发育树，有效区分了西花蓟马、烟蓟马和棕榈蓟马等。

PCR-RFLP技术需要筛选合适的限制性内切酶，且酶切条件要求严格，因此，寻找合适的酶将西花蓟马与其他众多常见种类的蓟马区分开，存在一定的难度;此外，PCR-RFLP后期的酶切反应及凝胶电泳，增加了 PCR产物被污染的机会(Walsh et al.，2005)。DNA序列分析法与PCR-RFLP技术往往联合使用，在得到序列信息的基础上根据软件预测限制内切酶的酶切位点，进而筛选合适的酶，以减少筛选酶的工作量(Brunner et al.，2002;Toda＆Komazaki，2002)。

2.4 SCAR 标记技术

SCAR分子标记检测技术，是在RAPD-PCR基础上扩增特异性产物的技术。SCAR标记技术包括3个步骤:(1)在对靶标昆虫DNA序列信息未知的情况下，通过合适的简并引物进行RAPD-PCR扩增与分析，得到靶标昆虫区别于其他昆虫的特异性条带;(2)对该特异性条带进行回收、克隆、测序，并根据片段两端的碱基序列设计特异性引物;(3)通过PCR扩增及电泳检测，鉴别靶标昆虫(黎裕等，1999)。该方法的优点是省却了大量的测序工作且无需对PCR产物进行RFLP分析，工作周期短，检测成本低，一旦获得特异引物就可用于大量的检测样本，因此在检测鉴定领域已有广泛应用。如孟祥钦等(2010)采用SCAR技术设计了1对引物FOMF/FOMR，该对引物只对西花蓟马具有扩增能力，对田间常见的其他41种蓟马不具有扩增效果;该对引物不仅对不同虫态的西花蓟马具有扩增能力，而且还可检测寄主植物组织中是否有西花蓟马卵的存在。

此外，亦有一些研究与此技术相仿，即针对序列信息已知的DNA片段设计种特异性引物，然后通过种特异性 PCR(species-specific PCR，SSP)扩增，进而鉴定蓟马种类。如Asokan et al.(2007)以棕榈蓟马和烟蓟马为对象，根据 Brunner et al.(2002)设计的针对mtDNA的引物扩增出约500 bp的片段，然后分别将2个片段进行克隆和再次测序，根据测序结果及其序列差异设计种特异性引物各1对(2RAf/5RAr和1RAf/5RAr)，分别对烟蓟马(298 bp)和棕榈蓟马(390 bp)进行扩增，进而达到种类鉴别的目的。周力兵等(2007)利用Brunner et al.(2002)设计的简并引物扩增出6种蓟马的mtDNA COI基因片段(450 bp)，然后针对西花蓟马片段设计种特异性引物 F.OL1/F.OR和 F.OL2/F.OR，快速简便地将西花蓟马的成虫、若虫、蛹与其他5种蓟马区分开。SSP技术是有选择地针对在遗传进化中易于区分的靶标基因设计特异性引物，进而达到检测鉴定物种的目的。该技术的关键在于靶标种特异性引物的设计;同时，为了避免所设计的引物与同域发生的近缘种产生交叉扩增，种内与种间核酸的差异亦应一并考虑(Darling＆Blum，2007;周力兵等，2007)。

2.5 qPCR 检测技术

qPCR技术是在常规PCR体系中加入荧光染料或带有荧光染料标记的探针，荧光信号随靶标DNA的扩增而增强，通过检测荧光信号判断目的DNA的数量，进而鉴定标本是否为靶标物种(Kox et al.，2005;Walsh et al.，2005;Huang et al.，2010)。与普通PCR相比，qPCR检测采用独特的全封闭反应管及光电传导系统，无需对PCR产物进行后处理，通过光电传导直接检测PCR扩增过程中荧光信号的变化并据此获得定量结果，实现了实时、在线定量检测的目的;同时，qPCR技术灵敏度更高，可以更加快捷、高通量地检测样品(Heid et al.，2009)。如 Walsh et al.(2005) 通过对棕榈蓟马、烟蓟马和西花蓟马基因组DNA进行RAPDPCR扩增和产物克隆，以含有插入序列的质粒合成DIG标记探针，然后将每个探针与棕榈蓟马及其他21种蓟马基因组DNA进行多重置换扩增反应(multiple displacement amplification reactions)和分子杂交，根据筛选到的棕榈蓟马特异性引物和相应的克隆设计TaqMan探针，并建立了qPCR检测体系。Huang et al.(2010)根据西花蓟马、花蓟马和梳缺花蓟马F.schultzei(Trybom)已知的RNA基因序列设计了2套西花蓟马特异性引物和探针，建立了西花蓟马qPCR检测体系，有效地将西花蓟马与其他常见的6种蓟马(花蓟马、梳缺花蓟马、烟蓟马、茶黄硬蓟马Scirtothrips dorsalis、Caliothrips fasciapennis、Tubulifera)区分开，并对若虫具有同样的检测效果，完全可用于口岸检疫。

2.6 蛋白质分析技术

2.6.1 Mab-ELISA检测法 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种灵敏性很高的检测技术。通常，抗原、抗体反应在固相载体-96孔酶标板孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤的方法去除多余的反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。单克隆抗体由免疫细胞与癌细胞融合后的杂交细胞(亦称杂种瘤)产生，只与特定的抗原决定簇结合，因此与其他近缘物种产生交叉反应的机率很低(Symondson，2002)，完全可用于物种识别。如Banks et al.(1998)以棕榈蓟马、烟蓟马、西花蓟马、桃蚜 Myzus persicae(Sulzer)、线斑潜蝇Liriomyza strigata(Meigen)、番茄斑潜蝇 L.bryoniae(Kaltenbach)等6种昆虫为对象，筛选出了可以准确鉴定棕榈蓟马的单克隆抗体及检测方法。然而，Mab制备周期长，条件要求苛刻，生产成本昂贵;ELISA检测方法需时较长，即使技术娴熟，完成整个检测过程至少也需要1.5 d。

2.6.2 SDS-PAGE检测法 SDS-PAGE法也是一种以蛋白质为靶标的检测技术。通常，在对靶标生物蛋白质进行电泳，得到蛋白电泳图谱的基础上，根据其差异条带鉴定靶标生物。该技术具有灵敏度高、电泳图谱清晰、种内差异小的优点。如Reboredo et al.(2003)以温室蓟马 Heliothrips haemorrhoidalis(Bouché)、西花蓟马和烟蓟马为靶标进行SDSPAGE检测，得到了可用于鉴定温室蓟马的特异性带型。然而，该技术稳定性较差，易受操作过程中诸多因素的影响，且当检测的物种较多时带型复杂。因此，目前已很少单独用于物种鉴定研究。

3 基于计算机软件的鉴定方法

随着信息技术的快速发展，电脑辅助的分类学技术应运而生。目前，电脑辅助的分类学应用主要有2类。(1)交互多路存储分类软件。为分布式，在CD-ROM(compact disc read-only memory)上几乎为完全自动的识别系统。如Moritz et al.(2000)根据形态学特征编制了一套可以鉴别缨翅目昆虫的软件——Thrips ID，该软件将缨翅目昆虫的形态学特征与分子信息相结合，并以数据库的形式进行储存。对于蓟马成虫，查询者只需根据标本的形态特征回答软件中的问题，即可确定其种类;对于成虫前的各个虫态，可以采用RFLP技术并根据所提供的ITS-RFLP酶切图谱进行种类鉴别。此方法不仅降低了错误鉴定的可能性，而且不受标本虫态和完整性的限制。(2)人工智能神经系统(artificial neural networks，ANN)。类似于人类大脑结构，能够根据样品的特征进行学习并概括出观测到的样品模型。与许多传统的统计模型相比，ANN为非线性，且未对模型或数据的统计分布式做前提假设，因此可用于所有多元数据集转换的电子图片的模式识别(Do et al.，1999)。如 Fedor et al.(2008)研究出了可半自动化识别4属18种蓟马的ANN，通过输入形态学特征不仅可以识别不同的种类，而且可以同时识别成虫的雌雄性，准确率达97%。

基于计算机软件的鉴定方法将形态学特征与分子生物学技术和数学模型进行有机地结合，有助于非蓟马分类人员快速准确地鉴定西花蓟马。然而，该方法仍然要求操作人员掌握蓟马类昆虫的形态学特征，且需要借助分子生物学技术才能识别幼体和残缺标本。

4 展望

步入21世纪以来，国际交流和经济活动日趋频繁，越来越多的外来物种进入我国，其传入数量之大、传播速度之快、经济危害之严重已远远超出了人们的想象(杨瑞等，2009)，显然，常规的分子检测技术已无法满足高通量检测的需求。DNA条形码(DNA barcoding)是一种以mtDNA COI基因前部长度约650 bp的序列作为物种内在标签，进而实现快速、准确和自动化地对物种进行鉴定和分类的新型系统(Hebert＆Gregory，2005)。由于其操作快速、简便，近几年已受到广泛关注并成为一项辅助物种鉴定的新手段。COI基因相对容易扩增，较少发生插入、缺失现象(Waugh，2007)，具有种内变异速率相对较小、种间相对较大(Hebert et al.，2003a、2003b)等优势。因此，目前已成为动物界常用的分子标记技术，并已显示出其在物种鉴定方面的巨大作用(Ekrem，2007;Frézal＆ Leblois，2008)。

基因芯片是新近崛起的生物技术，具有可以同时识别数以万计靶标的潜力(Naeole＆Haymer，2003)，目前已用于医学诊断中病毒和细菌(Striebel et al.，2003;朱晓光等，2007)、致病真菌(黄爱华等，2007)、人体寄生虫(张媛等，2007)的检测以及水产食品中常见病原微生物的鉴定(高爽等，2007)和植物病原真菌及其他病原物的识别研究(Lievens et al.，2005;Szemes et al.，2005)。 李 文 芬 等(2008)以双翅目实蝇科昆虫为靶标，针对mtDNA COI基因建立了我国进境植物检疫害虫地中海实蝇Ceratitis capitata(Wiedemann)、芒果小条实蝇C.cosyra(Walker)和纳塔尔小条实蝇C.rosa Karsch的生物芯片检测方法，为我国进口果蔬中检疫性实蝇的快速筛查和种类鉴定提供了技术保障。冯毅等(2009)以西花蓟马、花蓟马、禾花蓟马等3种花蓟马属昆虫的9个样本的COI基因片段序列为材料，以12种motif基因序列为靶标，制作虚拟基因芯片。检测结果显示，所设计的虚拟基因芯片能准确鉴定3种花蓟马，为实体基因芯片制作奠定了基础。

与传统的形态学鉴定技术相比，目前得以广泛应用的分子检测技术结果更加稳定可靠，但难以满足高通量检测的需求。基因芯片和DNA条形编码技术作为新兴的物种鉴定手段，在分子检测领域具有广阔的应用前景，且必将在有害生物检验检疫中发挥巨大作用。

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