转录抑制因子ZHX2功能片段原核表达载体的构建及表达

赵红蕾 曹 宏 孙月芳 田晓丰 (吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 30062)

转录抑制因子ZHX2功能片段原核表达载体的构建及表达

赵红蕾 曹 宏1孙月芳1田晓丰1(吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062)

目的 从人正常组织中克隆人转录抑制因子ZHX2功能片段，构建其原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，纯化获得蛋白，用于下一步探讨ZHX2基因的功能。方法 根据GenBank中ZHX2功能片段已知序列设计引物，从正常人组织中通过RT-PCR方法扩增ZHX2基因功能片段，克隆到原核表达载体pET28a(+)中，转化Ecoli.BL21(DE3)，IPTG诱导表达，采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果 测序结果显示克隆的ZHX2基因序列正确，SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确，Western-blot鉴定结果显示表达产物为人ZHX2功能片段特异性蛋白。结论 本研究成功构建了含有ZHX2功能片段的原核融合表达载体，并实现了ZHX2功能片段的表达，获得了纯化的蛋白，为进一步研究ZHX2基因的功能奠定了基础。

ZHX2基因;转录抑制因子;原核表达

ZHX(zinc-fingers and homeoboxes，ZHX)蛋白家族包括ZHX1、ZHX2和ZHX3，在人体组织中广泛存在，在组织中作为转录抑制因子发挥重要的病理生理功能〔1，2〕。ZHX2是ZHX蛋白家族成员之一，是2003年新克隆的转录抑制因子，位于染色体8q24.13，其编码的蛋白含837个氨基酸残基，定位于细胞核内〔3〕。近年来的研究结果显示，ZHX2参与正常肝细胞中肝癌标志物的转录抑制，提示ZHX2的表达缺失可能是肝细胞癌发生的关键因素〔4〕。本研究设计构建人ZHX2基因功能片段的原核表达载体，为进一步确定ZHX2蛋白发挥有效生物学作用的最小功能片段奠定基础，同时也为进一步研究ZHX2基因的功能提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒 大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)pLysS由本室保存，pMD-18T载体购自Takara公司，原核表达载体pET28a(+)由本室保存。

1.2 试剂 总RNA提取试剂盒Trizol reagent和逆转录试剂盒Thermoscript TM RT-PCR SYSTEM为GIBCo BRL公司产品;T4 DNA ligase为Promega公司产品;DL 2000 DNA Marker、质粒小量抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、X-gal、IPTG均购自TaKaRa公司;低分子量蛋白 Marker(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4 kU)购自上海生物化学研究所，窄谱预染蛋白质Marker(71、50、35、25、16、8 和 2 kU)购自赛百盛基因技术有限公司;ZHX2单克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology公司;HRP兔抗小鼠IgG购自北京中山金桥生物技术有限公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 引物设计 根据GenBank中人ZHX2 cDNA序列(gi：63079684)使用Prim 5软件在ZHX2基因的上下游设计F1和R1两条引物，上游引物F1：5'GAA TTC GTG ACA GAC ACA GCT GAG ATC C 3';下游引物 R1：5'CTC GAG GCC CCT TTG ACA CCG ATA T 3'，分别含EcoR I和Sal I酶切位点，理论扩增目的片段为837 bp，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.4 人ZHX2基因功能片段的克隆及测序 用Trizol reagent提取人正常肝组织总RNA，具体操作按文献〔5〕方法进行，沉淀置于室温干燥后加入30 μl水(含RNase inhibitor l μl)溶解，取3～5 μl进行琼脂糖凝胶电泳检查。立即进行逆转录或加入2倍体积的乙醇-80℃保存备用。逆转录和PCR反应严格按照试剂盒操作说明进行。取RNA 1 μg参照Quant script RT Kit试剂盒说明操作，取Quant Reverse Transcrplase 1 μl以及10×RT mix、dNTP 混合液(2.5 mmol/L)、Random(10 μmol/L) 各2 μl，加 DEPC 水定容至20 μl，37℃孵育60 min。所得 cDNA 用DEPC水稀释至50 μl置于-20℃保存备用。PCR扩增按50 μl体系进行，取2 μl逆转录产物为模板，以引物F1/R1对RT产物进行扩增，94℃，2 min预变性;循环参数为：94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 80 s，35个循环;然后72℃延伸7 min。扩增结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶。用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，并与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，PCR及酶切鉴定阳性克隆，初步鉴定成功的pMD-18T-ZHX2质粒送大连宝生物公司测序。

1.5 人ZHX2基因功能片段原核表达载体的构建 以EcoR I和Sal I对pMD-18T-ZHX2质粒和pET28a(+)载体双酶切，回收后连接、转换大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，筛选阳性克隆进行PCR和酶切鉴定。鉴定正确质粒命名为pET28a-ZHX2。

1.6 目的蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 将含有表达载体pET28a-ZHX2的宿主菌接种含卡那霉素(30 μg/ml)的LB液体培养基，37℃摇震培养至 OD600 0.4～0.6，加入终浓度1 mmol/L的IPTG诱导3～5 h，离心收集菌体，加入原培养液1/10体积的0.1 mol/L PBS重悬菌体，-20℃保存备用。培养液在4℃、5 500 r/min离心20 min，收集细胞沉淀物，沉淀物经超声裂解后用相同体积的PBS(pH7.0)重悬，沉淀和上清通过12 000 r/min离心20 min进行分离。进行SDS-PAGE检测分析，产物经Ni-NTA树脂纯化。把可溶上清液转移到纯化柱上，然后用5倍体积的PBS(pH7.0)溶液冲洗纯化柱。目的蛋白分别用含有10、20、50、100 mmol/L咪唑的 PBS(pH7.0)进行梯度洗脱。洗脱液经透析、浓缩、过滤除菌，Bradford法测定蛋白浓度后-70℃保存。

SDS-PAGE按文献〔5〕方法进行：灌制12%聚丙烯酰胺分离胶和5%的浓缩胶，取收集的上清20 μl和少量上样缓冲液混匀后上样，0.25%考马斯亮蓝R-250染色，凝胶成像系统扫描分析表达产物。Western印迹检测按文献〔6〕所述方法进行，转膜后在含有5%脱脂牛奶封闭液中封闭1 h，之后膜在1∶1 000的ZHX2单克隆抗体中4℃杂交过夜，第二天用PBS洗3次之后用1∶2 000的HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗杂交1 h，PBS洗3次，在ECL仪器上用ECL底物发光液显影。

2 结果

2.1 ZHX2的克隆测序结果 ZHX2基因功能片段RT-PCR扩增后得到特异性的目的片段，结果如图1所示，用引物F1/R1进行PCR，得到大小为837 bp的片段，扩增结果与预期相符。经测序，与GenBank序列信息一致。

2.2 ZHX2原核表达载体的构建和鉴定结果 菌落PCR结果表明，插入片段与目的片段大小一致。pET28a-ZHX2重组质粒用EcoR I和Sal I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明酶切后的片段大小约3 000 bp和837 bp，说明外源片段已插入。见图1。

2.3 ZHX2蛋白的诱导表达和鉴定结果 pET28a(+)-ZHX2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行目的蛋白的诱导表达，在30℃，0.4 mmol/L IPTG诱导4 h，诱导的表达产物经纯化后，取上清液进行SDS-PAGE电泳，结果显示有融合蛋白表达，分子质量约为31 kD，与预期相符合。Western印迹结果显示，纯化后的表达蛋白与商品化的ZHX2单克隆抗体在32 kD处出现特异性条带。见图1。

图1 ZHX2克隆、pET28a-ZHX2重组质粒及ZHX2蛋白诱导表达和蛋白结果

3 讨论

ZHX 蛋白家族分子结构中均包括两个锌指结构(zinc-finger motifs)和五个同源结构域(homeo domains，HDs)。三种蛋白自身可组成同源二聚体，两种蛋白相互之间也可形成异源二聚体，ZHX2在肝、肾、脾脏等不同组织中都有很广泛的表达〔7〕，近期研究显示ZHX2可能参与多种疾病的发生发展：ZHX2不仅抑制肝癌细胞AFP的表达，而且在肾病综合征中参与肾小球内足细胞的调控〔8〕;另有研究显示，ZHX2表达与多发性骨髓瘤恶性程度及患者愈后呈负相关〔9〕。上述研究提示ZHX2可能是一个重要的抑癌基因。

ZHX2和ZHX1具有较高的同源性，在编码序列和氨基酸序列上的同源性分别为45.5%和41.9%。ZHX2主要定位在核内，有两个核定位信号，位于第317位氨基酸和第446位氨基酸之间。ZHX2蛋白间可形成同源二聚体，也可以与同家族成员ZHX1或ZHX3形成异源二聚体，二聚体结合区位于HDI(第195位氨基酸和第358位氨基酸之间)。ZHX家族成员结构相似，分子量大小相近。因此，抗原设计时应尽量避开共同或相似结构域。Yamada〔4〕报道，ZHX2蛋白263AA～497AA之间有一个脯氨酸富集区，是不同于ZHX1和ZHX3的一个特殊结构域，通过BLAST对比分析ZHX家族氨基酸序列发现，ZHX2在263AA～497AA区域内较其他成员同源性低。王金金等〔10〕对人的ZHX2基因进行了真核表达，通过对表达结果的对比分析，将ZHX2的最小抑制区域缩小到242AA～501AA区域内。本研究根据上述研究结果，针对其设计的抗原片段更易产出特异性强的抗体，原核细胞中表达蛋白纯化后免疫动物获得血清，Western印迹结果显示制备的抗体具有良好的特异性。

ZHX2蛋白全长837个氨基酸，含有多个功能域，但并非所有功能域都具有抑制功能。Kawata等〔3〕构建了ZHX2系列缺失表达载体，经共转染实验和报告基因分析结果发现，ZHX2抑制cdc25基因启动子的最小抑制区域在氨基酸序列263～446范围内，这个区域包含了整个HD1区和脯氨酸富含区，但该功能域是否同样是ZHX2抑制AFP、参与HCC及多种疾病发生的最小功能域，迄今尚不清楚。本研究根据ZHX2的编码序列，成功构建了人ZHX2基因功能片段的原核表达载体pET28a-ZHX2，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下实现了目的蛋白的可溶性表达，Western印迹结果表明，本实验获得的表达蛋白为ZHX2基因特异性蛋白，为基因工程生产和改造ZHX2创造了条件，也为进一步阐明ZHX2基因的结构与功能及其在疾病发生中的作用奠定了基础。

1 Aussara Panyaa，Nunghathai Sawasdeeb，Chatchawan Srisawat.Expression of zinc finger and homeobox 2 in erythroleukaemic cells and gamma-globin expression〔J〕.Sci Asia，2010;36：342-5.

2 Shen H，Luan F，Liu H，et al.ZHX2 is a repressor of Alpha to protein expression in human hepatoma cell lines〔J〕.J Cell Mol Med，2008;12(6B)：2772-80.

3 Kawata H，Yamada K，Shou ZF，et al.Zinc-fingers and homeoboxes(ZHX)2，a novel member of the ZHX family functions as a transcriptional repressor〔J〕.Biochem J，2003;373(Pt3)：747-57.

4 Yamada K，Ogata-Kawata H，Matsuura K，et al.ZHX2 and ZHX3 repress cancer markers in normal hepatocytes〔J〕.Front Biosci，2009;14(1)：3724-32.

5 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T，著.金冬雁，黎孟枫，侯云德，译.分子克隆实验指南〔M〕.北京：科学出版社，2002：362-92.

6 潘 颖，毛丽君，孙艳霞，等.RhoC-miRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(3)：277-9.

7 Perincheri S，Dingle RW，Peterson ML，et al.Hereditary persistence of alpha-protein and H19 expression in liver of BALB/cJ mice is due to a retrovirus insertion in the ZHX2 gene〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(2)：396-401.

8 Liu C，Clement LC，Kanwar YS，et al.ZHX proteins regulate podocyte gene expression during the development of nephritic syndrome〔J〕.Biol Chem，2007;281(51)：39681-92.

9 Armelliui A，Sarasquete ME，Curca-Suuz R，et al.Low expression of ZHX2，but not RCBTB2 or RAN，is associated with poor outcome in multiple myeloma〔J〕.Br J Haematol，2008;141(2)：212-5.

10 王金金，史 伟，祁建妮，等.转录抑制因子ZHX2功能片段的克隆及表达〔J〕.山东大学学报(医学版)，2009;47(5)：1-4.

R996

A

1005-9202(2011)16-3115-03

1 吉林大学第二医院普外科中心

田晓丰(1976-)，男，博士后，主治医师，主要从事肝胆胰外科临床及基础研究。

赵红蕾(1987-)，女，硕士，主要从事分子免疫学研究。

〔2011-02-15收稿 2011-05-07修回〕

(编辑 徐 杰)