表没食子儿茶素没食子酸酯对人胰腺癌细胞株SW1990增殖的影响

彭凯 孔心涓 田字彬 张翠萍 赵清喜 魏良洲 王斌

·论著·

表没食子儿茶素没食子酸酯对人胰腺癌细胞株SW1990增殖的影响

彭凯 孔心涓 田字彬 张翠萍 赵清喜 魏良洲 王斌

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人胰腺癌细胞株SW1990增殖及细胞凋亡、细胞周期的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度EGCG(6.25、12.5、25、50、100 μg/ml)对体外培养的SW1990细胞增殖的影响；采用流式细胞仪检测EGCG(25 μg/ml)对SW1990细胞凋亡及不同浓度的EGCG(0、10、20、30、40、50 μg/ml)对SW1990细胞周期的影响。结果不同浓度EGCG (0、25、50 μg/ml)作用SW1990细胞24 h后，吸光度值(A492)分别为0.46±0.04、0.42±0.04、0.27±0.03，48 h后分别为0.48±0.02、0.31±0.03、0.16±0.02，72 h后分别为0.51±0.01、0.24±0.04、0.14±0.04，EGCG呈浓度及时间依赖性抑制SW1990的增殖(P<0.01)。25 μg/ml EGCG作用于SW1990细胞24、48、72 h后的细胞凋亡率分别为(8.33±1.15)%、(19.77±0.81)%、(29.17±0.75)%，而对照组相应的细胞凋亡率分别为(2.77±0.45)%、(3.20±0.26)%、(3.67±0.35)%，两组差异具有统计学意义(P<0.01)。0、20、50 μg/ml EGCG作用SW1990 细胞24 h后，G0/G1期细胞分别占(57.59±0.97)%、(62.99±1.91)%、(68.87±1.88)%，随着EGCG 浓度的增加，G0/G1期细胞比例明显增加，而S期和G2/M期细胞比例相应下降(P<0.01)。结论EGCG能明显抑制SW1990细胞的增殖，其机制可能与其诱导SW1990细胞凋亡及调控细胞周期有关。

胰腺肿瘤； 表没食子儿茶素没食子酸酯； 细胞凋亡； 细胞周期

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallae, EGCG)是茶多酚中比例最大、活性最高的单体成分[1]，对人和动物没有明显的不良反应[2]。已有实验研究表明，EGCG对直肠癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤均有促进细胞凋亡及抑制肿瘤生长的作用。本研究观察EGCG对人胰腺癌细胞株SW1990的生长抑制、凋亡作用，探讨其可能机制，为临床应用提供实验依据。

材料与方法

一、胰腺癌细胞株

人胰腺癌细胞株SW1990为青岛大学医学院病原微生物实验室保存。常规培养传代。

二、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖

取对数生长期的人胰腺癌细胞SW1990，按每孔5×105个细胞接种于96孔培养板。待细胞生长至75%～80%融合后加入新鲜配置的EGCG(成都曼思特生物科技有限公司，纯度为99%)，终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，每一浓度设5个复孔，对照组加入等量的RPMI-1640培养液。分别培养24、48、72 h后每孔加入5 mg/ml的MTT(Sigma公司)溶液20 ml，继续避光培养4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl二甲亚砜，避光室温下充分震荡10 min。在酶联免疫检测仪上测定492 nm波长下的吸光度(A)值。

三、流式细胞仪检测细胞凋亡

按照Annexin Ⅴ-PE+7-AAD凋亡检测试剂盒(美国Millipore Guava technologies公司)说明书操作。SW1990细胞培养36 h后加入新鲜配制的25 μg/ml的EGCG，以不加EGCG作为对照，分别继续培养24、48、72 h后收集细胞。离心后用100 μl无血清培养基重悬细胞，加入100 μl Guava Nexin Reagent避光孵育20 min，应用Guava EasyCyte Mini 0500-1430流式细胞仪检测。

四、流式细胞仪检测细胞周期

按照Guava®细胞周期检测试剂盒(美国Millipore Guava Technologies公司)说明书操作，待细胞生长至75%～80%融合后换无血清RPMI-1640培养液培养48 h以周期同步化，之后分别加入10、20、30、40、50 μg/ml的EGCG继续培养24 h，以不加EGCG的细胞作为对照。胰酶消化、离心收集细胞，PBS洗涤后以100 μl PBS重悬细胞，逐滴加入-20℃的70%冰乙醇，4℃固定过夜。然后离心弃上清，PBS洗涤加入200 μl细胞周期试剂液重悬细胞，室温孵育30 min，上流式细胞仪检测。

五、统计学处理

结 果

一、EGCG对SW1990细胞增殖的影响

6.25、12.5 μg/ml EGCG对SW1990细胞生长无明显抑制作用，25 μg/ml以上EGCG呈浓度及时间依赖性抑制SW1990的增殖(图1)。倒置显微镜下观察到细胞变圆、皱缩、胞质减少、核质比例增大、细胞与细胞之间的间隙明显增大(图2)。

图1 不同浓度EGCG对SW1990细胞的生长抑制作用

图250 μg/ml EGCG作用24(a)、48(b)、72 h(c)后SW1990的形态(×100)

二、EGCG对SW1990细胞凋亡的影响

对照组细胞培养24、48、72 h后凋亡率波动于(2.77±0.45)%～(3.67±0.35)%，无明显变化。25 μg/ml EGCG作用24、48、72 h后细胞凋亡率分别为(8.33±1.15)%、(19.77±0.81)%、(29.17±0.75)%，均较对照组显著增加(P<0.01)，且随着作用时间的延长凋亡细胞不断增加(P<0.01)。

三、EGCG对SW1990细胞周期的影响

EGCG作用后SW1990细胞的G0/G1期细胞数较对照组增加(P值<0.05或<0.01)，且高浓度EGCG(30、40、50 μg/ml)导致的G0/G1期细胞数增加较低浓度EGCG(10、20 μg/ml)更显著(P<0.01)；同时，S期细胞及G2/M期细胞数均较对照组明显减少(P值均<0.01，表1)。

组 别G0/G1期S期G2/M期对照组57．59±0．9720．05±0．2022．35±1．0410μg/ml组61．78±2．03a19．29±0．9818．91±1．14b20μg/ml组62．99±1．91b18．81±1．2718．19±0．78b30μg/ml组68．48±3．47bc15．49±1．50b16．03±1．98b40μg/ml组67．63±0．48bc14．64±0．51b17．72±0．88b50μg/ml组68．87±1．88bc14．56±0．22b16．57±1．76b

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与10、20 μg/ml组比较，cP<0.01

讨 论

茶叶中富含多酚类化合物，茶多酚化合物包括黄烷醇、黄酮类和茶多酚酸类，其中黄烷醇约占到多酚类物质总量的80%，通称为茶儿茶素。茶儿茶素主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表儿茶素，其中以EGCG为主要成分，含量约占到茶儿茶素的50%，是茶多酚中比例最大、活性最高的单体成分[1]。文献报道[2]，EGCG对胃癌、肝癌、食管癌、直肠结肠癌、皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌及前列腺癌等肿瘤均有促凋亡及抑制肿瘤生长的作用，同时对正常细胞无明显影响。流行病学亦证实饮用绿茶可以防治肿瘤的发生和转移[3]，Yuan等[4]在上海对18 244人进行的前瞻性队列研究证实，茶儿茶素能有效防止人结肠癌的发生。Tan等[5]研究亦发现EGCG可抑制人胰腺癌PANK-1细胞增殖。本实验结果显示，EGCG(>25 μg/ml)呈时间-剂量依赖性对SW1990细胞具有明显的增殖抑制作用，且细胞凋亡率增加。

肿瘤细胞的一个共同特征是细胞周期调控机制的破坏导致细胞的失控性生长。众多的癌基因、抑癌基因参与细胞生长、分裂、死亡的调控，最终表现为对细胞周期的调控。细胞周期存在两个主要的限制点：G0/G1、G2/M限制点，其中G0/G1限制点是影响细胞周期的关键，只要有相应的生长因子存在，G1期正调节因子累积达到一定程度，细胞就能通过该限制点进入S期，一旦越过该点，细胞就不再依赖细胞外促生长因子而依次完成整个细胞周期。G2/M限制点与细胞有丝分裂有关。本实验结果显示，EGCG可使SW1990细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，相应的G2/M期细胞比例减小，当EGCG浓度>30 μg/ml时相应的S期细胞比例也降低，推测EGCG可能通过诱导人胰腺癌细胞SW1990使之阻滞于G0/G1期而发挥其抑制增殖的效应，具体机制有待进一步研究。

[1] 方芳，崔志清，韩永晶.茶儿茶素的药效研究概况．中草药，2000,31:396-398.

[2] Johnson JJ,Bailey HH,Mukhtar H.Green tea polyphenols for prostate cancer chemoprevention:a translational perspective.Phytomedicine,2010,17:3-13.

[3] Yang CS,Wang ZY.Tea and cancer.J Natl Cancer Inst,1993,85:1038-1049.

[4] Yuan JM,Gao YT,Yang CS,et al.Urinary biomarkers of tea polyphenols and risk of colorectal cancerin the Shanghai Cohort Study.Int J Cancer,2007,120:1344-1350.

[5] Tan M,Norwood A,May M,et al.Effects of (-)epigallocatechin gallate and thymoquinone on proliferation of a PANC1 cell line in culture.Biomed Sci Instrum,2006,42:363-371.

2010-11-30)

(本文编辑：吕芳萍)

Anti-proliferativeeffectofepigallocatechin-3-gallateonhumanpancreaticcancercellSW1990

PENGKai,KONGXin-juan,TIANZi-bin,ZHANGCui-ping,ZHAOQing-xi,WEILiang-zhou,WANGBin.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospital,MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266003,China

TIANZi-bin,Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

ObjectiveTo investigate the apoptosis-inducing effect and anti-proliferative effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on human pancreatic cancer cell SW1990 in vitro.MethodsThe effect of proliferationwas evaluated by MTT after the SW1990 cells in vitro were incubated with different concentrations of EGCG (6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml). The apoptosis-inducing effect was determined by flow cytometry after the cells were treated with 25 μg/ml of EGCG. The cell cycle of SW1990 cells was detected by flow cytometry after the cells incubated with different concentrations of EGCG (0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml).ResultsAfter SW1990 cell were treated with different concentrations of EGCG(0, 25, 50 μg/ml), the values of A492were 0.46±0.04,0.42±0.04,0.27±0.03 at 24 h; 0.48±0.02, 0.31±0.03,0.16±0.02at 48 h; 0.51±0.01,0.24±0.04,0.14±0.04 at 72 h. EGCG inhibited the proliferation of SW1990 in a dose- and time-dependant manner(P<0.01). The apoptotic rates at 24, 48, 72 h were (8.33±1.15)%, (19.77±0.81)%, (29.17±0.75)% in the EGCG treatment group; while the corresponding values were (2.77±0.45)%,(3.20±0.26)%, (3.67±0.35)% in the control group; and the difference was statistically significant (P<0.01). After 0, 20, 50 μg/ml of EGCG treatment for 24 h, the percentages of

SW1990 cellsin G0/G1stage were (57.59±0.97)%, (62.99±1.91)%, (68.87±1.88)%, and the percentages of SW1990 cells in G0/G1stage increased with the increase of concentrations of EGCG, while the percentages of SW1990 cells in G2/M stage decreased with the increase of concentrations of EGCG (P<0.01).ConclusionsEGCG can significantly inhibit the proliferation of SW1990 cells. The mechanism may be related to the apoptosis-inducing effect and the regulation of the cell cycle of the SW1990 cells.

Pancreatic neoplasms； Epigalocatechin-3 gallate； Apoptosis； Cell cyle

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.008

266003 青岛市，青岛大学医学院附属医院消化内科(彭凯、孔心涓、田字彬、张翠萍、赵清喜、魏良洲)；青岛大学医学院(王斌)

彭凯，Email：eoert@163.com

田字彬，Email: tianzb@qdumh.qd.sd.cn