VEGF基因沉默对胰腺癌细胞化疗敏感性和Akt信号通路的影响

王晓燕 周永静 龚丹丹 徐军 徐岷 范钰

·论著·

VEGF基因沉默对胰腺癌细胞化疗敏感性和Akt信号通路的影响

王晓燕 周永静 龚丹丹 徐军 徐岷 范钰

目的观察靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)对胰腺癌BxPC3细胞化疗药物敏感性的影响，并探讨其可能机制。方法将培养后的BxPC3细胞分为单纯BxPC3细胞组、脂质体处理组、错配siRNA转染组和VEGF siRNA转染组。以5、10、20、100、200 nmol/L的VEGF siRNA转染BxPC3细胞。采用实时定量RT-PCR和ELASA法检测细胞VEGF mRNA 和蛋白的表达；MTT法检测吉西他滨对各组细胞生长的影响；蛋白质印迹法检测BxPC3细胞Akt蛋白的磷酸化。结果VEGF siRNA转染后，BxPC3细胞VEGF mRNA和蛋白呈浓度和时间依赖性明显下调，但对BxPC3细胞的增殖无明显影响。用0.2 μmol/L吉西他滨处理细胞48 h后，BxPC3细胞组、错配siRNA组及5、10、20 nmol/L siRNA组细胞的生长抑制率分别为(16.9±0.3)%、(17.3±0.3)%、(28.8±0.4)%、(52.2±0.3)%、(75.4±0.4)%，抑制率与siRNA浓度相关(r=0.928)。同时， siRNA转染后细胞Akt蛋白的磷酸化被明显抑制。结论VEGF基因在胰腺癌BxPC3细胞耐药中起着重要的作用，其机制可能与Akt蛋白磷酸化有关。

胰腺肿瘤； 血管内皮生长因子； RNA,小分子干扰； 化疗敏感性； Akt

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一个强有力的促血管生成因子，在与血管内皮细胞增生相关的生理和病理过程中起重要作用，特别是与实体瘤的关系密切[1]。Takeda等[2]发现，VEGF高表达与癌细胞侵袭、转移密切相关。最近有学者发现，VEGF在部分肿瘤耐药中发挥着重要的作用[3]，但在胰腺癌中的研究较少。本研究应用靶向VEGF的小干扰RNA(siRNA)转染胰腺癌BxPC3细胞，观察其对化疗敏感性的影响，并探讨其可能的机制。

材料与方法

一、细胞培养及转染

人胰腺癌细胞BxPC3由本院组织细胞生物库冻存，解冻后常规培养。将对数生长期细胞以1.0×105个细胞接种于24孔培养板培养24 h。分为单纯BxPC3细胞组、单纯脂质体处理组、错配siRNA(Scr-siRNA)转染组和靶向VEGF的siRNA转染组。Scr-siRNA正义链序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTDTD-3′，转染细胞浓度为200 nmol/L。VEGF siRNA的正义链序列为5′-GGAGUACCCUGAUGAGAUCDTDT-3′，转染浓度为5、10、20、100、200 nmol/L。siRNA由美国Dharmacon公司合成。应用OligofectamineTM2000(Santa Cruz公司)转染细胞，按说明书操作。

二、实时定量RT-PCR检测VEGF mRNA

收集转染24、48、72 h后的各组细胞，Trozol抽提细胞总RNA，逆转录cDNA，PCR 扩增。VEGF上游序列5′-GCCTTGCCTTGCTGCTCTAC-3′，下游序列5′-TTCTGCCCTCCTCCTTCTGC-3′，扩增片段638 bp；FAM探针序列5′-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3′ TAMRA；以GAPDH为内参。PCR反应条件：50℃ 2 min,95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1min，40个循环。mRNA表达量为2-ΔCt，其中△Ct=Ct转染组-CtBxPC组。以BxPC3组细胞表达量为100%，计算其他各组的表达百分率。

三、ELASA法检测VEGF蛋白

收集转染48 h的各组细胞，细胞计数后制备匀浆，采用ELISA试剂盒(R&D公司)检测VEGF蛋白含量，操作步骤参照说明书进行。终止反应后15 min内用酶标仪测A450值。根据标准品浓度及对应的A450值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的A450值计算出对应的样品浓度。

四、MTT法检测胰腺癌细胞增殖

收集培养24、48、72 h后的各组细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度，以每孔103个细胞接种于96孔板内，应用MTT法检测细胞增殖。

五、胰腺癌细胞化疗敏感性检测

BxPC3细胞转染48 h后，加入终浓度为0.2 μmol/L吉西他滨继续培养24 h，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，培养4 h后去上清，加二甲基亚砜0.1 ml，用酶标仪测A570值。以不加吉西他滨作为对照组，每组5复孔。化疗药物对细胞生长抑制率(IR)=(1-A570吉西他滨组)/A570对照组×100%。

六、Akt磷酸化蛋白(p-Akt)检测

收集上述各组细胞，PBS洗涤后用PBS重悬，加入蛋白提取液，煮沸振荡，离心取上清。蛋白定量后，采用蛋白质印迹法检测p-Akt，以β-actin为内参。

七、统计学方法

结 果

一、BxPC3细胞VEGF mRNA表达的变化

siRNA转染胰腺癌细胞后，VEGF mRNA表达呈浓度和时间依赖性明显降低(P<0.001)；而BxPC3组、脂质体组、Scr-siRNA组细胞VEGF mRNA的表达均无明显变化。

二、BxPC3细胞VEGF蛋白表达的变化

BxPC3组、脂质体组细胞VEGF蛋白表达量分别为(2689±27)pg/106cells、(2675±32)pg/10cells，两组间无明显差异；5、10、20 nmol/L siRNA转染组细胞VEGF蛋白表达量分别为(1678±28)pg/106cells、(1236±22)pg/106cells、(828±39)pg/106cells，较BxPC3组呈浓度依赖性明显下降(P<0.01)。

三、BxPC3细胞增殖的变化

siRNA转染后BxPC3细胞的增殖无明显变化(图1)。

图1 BxPC3组(a)和siRNA组(b)细胞的增殖(MTT法 ×100)

四、BxPC3细胞对化疗药物敏感性的变化

吉西他滨处理后，BxPC3组、错配siRNA组细胞的增殖抑制率分别为(16.9±0.33)%、(17.3±0.3)，无显著差别；5、10、20 nmol/L siRNA组细胞的增殖抑制率分别为(28.8±0.4)%、(52.2±0.3)%、(75.4±0.4)%，呈浓度依赖性细胞增殖(r=0.928)。吉西他滨对各浓度siRNA转染的胰腺癌细胞生长均有明显的抑制作用。

五、BxPC3细胞p-Akt表达的变化

siRNA呈浓度依赖性抑制Akt蛋白的磷酸化(图2)。

图2 siRNA各浓度组细胞p-Akt蛋白的表达

讨 论

VEGF家族成员包括VEGF-A(即通常所指的VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(placenta growth factor，PIGF)。VEGF mRNA经不同的剪切方式可得到7种不同的同功型，其氨基酸残基数分别为121、145、148、165、183、189、206，最常见的是165个氨基酸，206个氨基酸较少见，并只在胎肝中发现。近年研究证明[4-5]，VEGF在组织器官的发生、正常状态的维持、多种肿瘤的发生、发展以及转移中都发挥着重要作用。

本实验结果显示，靶向VEGF的siRNA转染胰腺癌BxPC3细胞后，细胞VEGF mRNA和蛋白表达呈浓度和时间依赖性被抑制，表明siRNA转染成功。

靶向VEGF的siRNA转染后，对BxPC3细胞增殖无明显影响，但能明显地增强细胞对吉西他滨的化疗敏感性，与Sun等[6]的报道结果类似。提示VEGF基因下调可增强化疗药物对VEGF高表达的癌细胞的化疗敏感性。许多研究显示[7-8]，Akt信号通路在许多癌细胞耐药中发挥着重要的作用。Akt也称蛋白激酶B(protein kinase B)，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其激酶结构域与蛋白激酶A和蛋白激酶C有70%的同源性。它可以被许多生长因子如血小板衍生生长因子、表皮生长因子和神经生长因子等通过激活PI-3K (phosphoinositide 3- kinase)，活化PI-3K-PKB(Akt)信号通路。激活的Akt可以磷酸化胱冬蛋白酶-9(caspase-9)前体蛋白和Bad而使它们失活, 从而在保护细胞免于凋亡中起着重要作用[9]。本结果显示，靶向VEGF的siRNA转染可明显抑制BxPC3细胞Akt蛋白磷酸化水平，且呈浓度依赖性，提示VEGF基因过表达在胰腺癌细胞化疗耐药性中起着重要的作用，其机制与Akt蛋白磷酸化有关。

[1] Maehara Y,Kakeji Y,Oda S,et al.Tumor growth patterns and biological characteristics of early gastric carcinoma.Oncology,2001,61:102-112.

[2] Takeda A,Stoeltzing O,Ahmad SA,et al.Role of angiogenesis in the development and growth of liver metastasis.Ann Surg Oncol,2002,9:610-616.

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[5] Schoppmann SF,Birner P,Stockl J,et al.Tumor-associated macrophages express lymphatic endothelial growth factors and are related to peritumoral lymphan giogenesis.Am J Pathol,2002,161:947-956.

[6] Sun P,Gao J,Liu YL,et al.RNA interference (RNAi)-mediated vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C) reduction interferes with lymphangiogenesis and enhances epirubicin sensitivity of breast cancer cells.Mol Cell Biochem,2008,308:161-168.

[7] Harvey RD,Lonial S.PI3 kinase/AKT pathway as a therapeutic target in multiple myeloma.Future Oncol,2007,3:639-647.

[8] Markman B,Atzori F,Pérez-García J,et al.Status of PI3K inhibition and biomarker development in cancer therapeutics.Ann Oncol,2010,21:683-691.

[9] Hemmings BA.Akt signaling: linking membrane events to life and death decisions.Science,1997,275: 628-630.

2010-08-09)

(本文编辑：吕芳萍)

EffectsofVEGFdownregulationbysmallinterferingRNAonchemosensitivityandAktsignalpathwayofhumanpancreaticcancercell

WANGXiao-yan,ZHOUYong-jing,GONGDan-dan,XUJun,XUMin,FANYu.

CancerInstitute,ZhenjiangMunicipalPeople′sHospital,JiangsuUniversity,Zhenjiang212002,China

FANYu,Email：yuf36@sina.com

ObjectiveTo study the effects VEGF small interfering RNA (siRNA) on chemosinsitivity of human BxPC3 cell and its mechanism.MethodsBxPC3 cells were divided into single BxPC3 cell group, lipofection group, scrambled siRNA transfection (200 nmol/L) group, VEGF siRNA transfection group. VEGF siRNA (5, 10, 20, 100, 200 nmol/L) was used to transfect BxPC3 cells. Expressions of VEGF mRNA and protein were determined by real-time PCR and ELISA assay, respectively. MTT was performed to examine the inhibitory effects of gemcitabine on BxPC3 cells of each group. The phosphorylated-Akt protein was evaluated by Western blotting.ResultsAfter VEGF siRNA transfection, the expression of VEGF mRNA and protein in BxPC3 cells was down-regulated in a dose-and time-dependent manner, but there was no effect on BxPC3 cells proliferation. After 0.2 μmol/L of gemcitabine treatment for 48 h, the inhibitory rates were (16.9±0.3)%, (17.3±0.3)%, (28.8±0.4)%, (52.2±0.3)%, (75.4±0.4)% in BxPC3 cell group, lipofection group, 5,10,20 nmol/L VEGF siRNA transfection group, and the inhibitory effects were correlated with siRNA concentration (r=0.928). The phosphorylated-Akt protein was reduced significantly in siRNA transfected cells.ConclusionsVEGF gene plays an important role in BxPC3 cells resistence to chemotherapy through inhibiting Akt phosphorylation.

Pancreatic neoplasms; Vascular endothelial growth factor; RNA, small interfering; Chemosensitivity; Akt

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.006

镇江市社会发展基金(SH2009014)；镇江市卫生事业发展基金(WS0908)

212002 江苏镇江，江苏大学附属人民医院肿瘤研究所(王晓燕、周永静、龚丹丹、徐军、范钰)；江苏大学附属医院消化科(徐岷)

范钰，Email：yuf36@sina.com