尖顶羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究

潘志福， 兰 瑛，2， 张 松*

(1.华南师范大学生命科学学院，广东广州 510631； 2.深圳市国想生物科技有限公司，广东深圳 518114)

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究

潘志福1， 兰 瑛1，2， 张 松1*

(1.华南师范大学生命科学学院，广东广州 510631； 2.深圳市国想生物科技有限公司，广东深圳 518114)

用尖顶羊肚菌胞外多糖提取物检测了对超氧阴离子、羟基自由基及ABTS自由基的抑制作用，用其灌胃衰老模型小鼠，观察其对小鼠大脑超氧化物歧化酶活性(SOD)、脂褐素(LF)和丙二醛(MDA)含量的影响.结果表明：2 mg/mL多糖提取物对超氧阴离子的抑制率为43.06%，1 mg/mL多糖提取物对羟基自由基的抑制率为72.40%， 0.1 mg/mL多糖提取物对ABTS自由基的抑制率为77.43%；50 mg/(kg·d)的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性、雌性小鼠脑SOD活性分别提高20.70%、21.13%， LF含量分别降低35.14%、46.93%，MDA含量分别减少15.10%、15.61%.表明尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗氧化和延缓衰老作用，对雌性小鼠效果略优于对雄性小鼠.

尖顶羊肚菌； 胞外多糖； 抗氧化

尖顶羊肚菌是一种珍稀的食药用真菌，研究发现，它有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、降血脂及抗菌等作用，具有重要的开发和利用价值[1-4].多糖是其主要的活性物质，然而关于尖顶羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化和延缓衰老的研究尚不多见.本研究通过液体培养获得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物，检测其对超氧阴离子自由基、羟基自由基及ABTS自由基的抑制作用，研究其体外抗氧化活性，并将尖顶羊肚菌胞外多糖提取物灌胃衰老模型小鼠，观察其对小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、脂褐素(LF)、丙二醛(MDA)等的影响来研究其抗氧化作用，为认识其作用机制和开发健康食品提供实验依据.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌种 尖顶羊肚菌(Morchellaconica)，由华南师范大学生命科学学院提供.

1.1.2 实验动物 昆明种小鼠，SPF级，体质量(20±2)g由中山医科大学动物实验中心提供，饲养环境温度24～26 ℃，许可证号：SCXK(粤)2004-0011.

1.1.3 主要试剂 2,2联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、抗超氧阴离子试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒、LF试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；D-半乳糖购自上海伯奥生物科技有限公司；维生素E购自广州星群(药业)股份公司.

1.2方法

1.2.1 尖顶羊肚菌胞外多糖的提取 将尖顶羊肚菌接种到液体培养基(葡萄糖50 g、NH4NO32 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、维生素B10.1 g,蒸馏水定容至1 L，pH调至6.5)，26 ℃、180 r/min培养10 d，收集培养液，浓缩，Sevag法去蛋白，加95%乙醇沉淀，将沉淀物真空冷冻干燥,获得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物[5](简称多糖提取物，下同). 其主要成分为：总糖含量59.40%；蛋白质含量7.88%.

1.2.2 多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制作用 模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，测定多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制率，测定的具体方法参照抗超氧阴离子试剂盒说明书.

1.2.3 多糖提取物对羟基自由基的抑制作用 参照柳红[6]的方法，利用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系测定提取物对羟基自由基的抑制率.

1.2.4 多糖提取物对ABTS自由基抑制作用 按照文献[7-8]的方法并稍加改进，测定多糖提取物对ABTS自由基的抑制率.

1.2.5 小鼠生理生化实验 将小鼠随机分为空白对照组、造模组、阳性对照组、多糖提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组共6个组，每组10 只，雌雄各半，自由进食和饮水，造模组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组每天腹腔注射剂量为120 mg/(kg·d)的D-半乳糖溶液0.2 mL，空白对照组注射等量的生理盐水，连续注射42天.低、中、高剂量组分别灌胃尖顶羊肚菌多糖提取物为50、200、800 mg/(kg·d)，阳性对照组灌胃量为800 mg/(kg·d)的维生素E，空白对照组和造模组分别灌胃生理盐水，各组小鼠的灌胃量均为0.2 mL，连续灌胃42天，实验结束后，断颈法取脑，在超声波细胞粉碎仪制成大脑匀浆，离心后，取上清液，用黄嘌呤氧化酶法测定小鼠的SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，荧光比色法测定LF含量，测定的具体方法均参照试剂盒说明书. 数据采用DPS 3.01 软件进行统计，采用LSD(least significant difference)法(最小显著性差异法)进行方差分析.

1.2.6 肝脏切片组织的观察 取出小鼠肝脏，体积分数10%的福尔马林溶液保存，按常规石蜡切片制作方法，梯度乙醇脱水处理、石蜡包埋、二甲苯脱蜡，伊红-苏木素染色，在光学显微镜下观察肝脏切片的组织形态.

2 结果与分析

2.1多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制作用

多糖对超氧阴离子自由基的清除能力以抑制率表示，抑制率越高，说明多糖抗氧化作用越强.图1可见，低质量浓度时，维生素C(Vc)对超氧阴离子自由基的抑制率较高，随质量浓度的增大，多糖提取物和Vc二者对超氧阴离子自由基抑制效果接近.达到2 mg/mL时，多糖提取物的抑制率为43.06%，这表明多糖提取物对超氧阴离子自由基具有一定的抑制作用，且抑制效率与多糖提取物质量浓度呈正相关.

图1 尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制作用

Figure 1 Inhibition of the exopolysaccharide extract fromM.conicaon uperoxide anion

2.2多糖提取物对羟基自由基的抑制作用

图2显示，多糖提取物和Vc均具有抑制羟基自由基的能力，它们的抑制能力均与其质量浓度呈正相关.抑制率为50%对应的提取物质量浓度为0.81 mg/mL;当质量浓度为1 mg/mL时，提取物对羟基自由基的抑制率为72.4%.这表明多糖提取物对羟基自由基具有一定的抑制能力.

图2 尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对羟基自由基的抑制作用

Figure 2 Inhibition of the exopolysaccharide extract fromM.conicaon hydroxyl radical

2.3多糖提取物对ABTS自由基的抑制作用

图3显示多糖提取物对ABTS自由基具有较好的抑制作用，随着多糖提取物质量浓度的增加，对ABTS自由基的抑制能力逐渐加强，当抑制率为50%时，分别对应的多糖提取物质量浓度为0.026 mg/mL、Vc 质量浓度为0.027 mg/mL.当质量浓度为 0.1 mg/mL时，提取物对ABTS自由基的抑制率为77.43%.说明多糖提取物对ABTS自由基有较强的抑制能力.

图3 尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对ABTS自由基的抑制作用

Figure 3 Inhibition of the exopolysaccharide extract fromM.conicaon ABTS radical

2.4多糖提取物对小鼠脑SOD活性、LF和MDA的影响

从表1可知，多糖提取物在50 mg/(kg·d)的剂量下使雄性小鼠脑SOD活性提高20.70%(P<0.01),脑LF含量降低35.14%(P<0.01)，脑MDA含量降低15.10%；其对雌性小鼠脑SOD活性提高21.13%(P<0.05)，脑LF含量降低46.93%(P<0.01)，脑MDA含量降低15.61%(P<0.05)，小鼠SOD活性比阳性对照组高， LF含量比阳性对照组低.

200 mg/(kg·d)多糖提取物能使雄性小鼠脑LF含量降低24.32%(P<0.01)，MDA含量降低18.68%；其使雌性小鼠脑LF含量、MDA含量分别降低45.91%(P<0.01)、19.41%(P<0.05)，但是对雄性和雌性小鼠脑SOD活性均与模型组没有显著差异.

800 mg/(kg·d)的多糖提取物能使雄性小鼠脑LF含量降低29.73%(P<0.01)，MDA含量降低19.13%(P<0.05)，脑SOD活性则比模型组降低13.20%，但没有显著差异(P>0.05)；其能使雌性小鼠脑LF含量、MDA含量分别降低32.65%(P<0.01)、23.07%(P<0.05)，使脑SOD活性提高了18.02%(P<0.05).

图4表明，通过与模型组比较,多糖提取物对小鼠的LF影响最大，本实验所设置的3个剂量组中，50 mg/(kg·d)(低剂量组)使LF含量增加优于阳性对照组，且具有性别的差异，对雌性小鼠的LF作用略优于对雄性小鼠的作用.

Y轴表示各组与模型组比较，SOD活性增加的百分比以及LF、MDA减少的百分比.

图4 不同剂量的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对雌雄小鼠SOD、LF和MDA影响的比较

Figure 4 Comparison on the exopolysaccharide extract fromMorchellaconicaPers with diversed dosages affecting SOD, LF and MDA of male and female mice

表1 尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对小鼠脑SOD活性、LF、MDA的影响Table 1 Effects of the exopolysaccharide extract from Morchella conica Pers on SOD，LF，MDA in mice brain(±s)

注:与模型组比较，*:P<0.05;**:P<0.01.

2.5小鼠肝脏切片的组织形态

模型组雄性小鼠肝组织切片(图5a)中细胞核凝聚，细胞质皱缩，细胞呈现干枯状，表现出衰老状态；50 mg/(kg·d)(低剂量组)多糖提取物灌胃的雄性小鼠肝组织切片(图5b)边界清晰，细胞形态较为正常.

3 讨论

衰老是生物界的普遍现象,一般与体内自由基含量有关.细胞组织受到自由基攻击后，生物大分子发生变形、断裂，破坏细胞结构和功能，从而导致机体衰老[9]. 羟基自由基及超氧阴离子等自由基引发的体内脂质过氧化是机体衰老的重要原因[10].本研究发现，尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基具有抑制作用，并呈一定的量效关系.这表明尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有清除自由基，阻断自由基反应链，降低自由基对机体组织、细胞结构及生物大分子的损害作用.

图5 雄性小鼠肝脏组织的切片

机体存在多种抗氧化物酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等具有相互协调作用来清除自由基[9].超氧化物歧化酶能有效清除自由基，发挥抗氧化作用，MDA是自由基攻击机体组织导致脂质过氧化的主要产物，而LF是机体老化的代谢产物，能反映其氧化损伤的程度.食药用菌多糖能降低过氧化脂质含量、提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力[11].牛肝菌胞外多糖能有效清除超氧阴离子自由基和抑制羟基自由基产生，减少小鼠肝组织MDA含量[12].栎金钱菌活性提取物通过提高衰老模型小鼠血清SOD活性、减少肝MDA含量和LF含量，具有良好的抗氧化和延缓衰老效果[13].本研究发现，50 mg/kg·d尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能提高雌性小鼠SOD活性21.13%，降低LF含量46.93%和MDA含量15.61%.表明尖顶羊肚菌胞外多糖提取物可提高SOD活性，抑制了体内羟基自由基、超氧阴离子等自由基，保护机体组织免受自由基损伤，减少了丙二醛、脂褐素等衰老产物，从而延缓机体衰老.

食药用菌活性提取物抗氧化与延缓衰老的效果有性别差异.栎金钱菌活性提取物对雄性小鼠的抗衰老效果比雌性好[13].本研究发现尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对雌性小鼠的延缓衰老效果要略优于对雄性小鼠.这可能与尖顶羊肚菌胞外多糖提取物调节雌性激素及类似物有关，因为雌性激素可以促进抗衰老基因的表达，减少体内自由基产生，某些雌性激素类似物还具有延寿的效果[14].

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物是一种无毒具有开发潜力的天然抗氧化剂资源，它能有效提高脑SOD活性，降低脑LF和MDA含量，抑制羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基，具有良好的抗氧化效果.

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Keywords：Morchellaconica; exopolysaccharide; superoxide radical; hydroxyl anion radical; ABTS free radical; antioxidant; antiaging

【责任编辑 成 文】

STUDYONTHEANTIOXIDATIVEANDANTIAGINGEFFECTSOFTHEEXOPOLYSACCHARIDEEXTRACTFROMMORCHELLACONICA

PAN Zhifu1, LAN Ying1，2, ZHANG Song1*

(1.School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China，
2.Guoxiang Biological Science and Technology Co,Ltd., Shenzhen 518114, China)

Inhibitions of the exopolysaccharide extract fromMorchellaconicaon superoxide anion, hydroxyl radical and ABTS free radical were tested for evaluating the in-vitro-antioxidant activity. And through gastric perfusion to aging model mice, effects of the extract on superoxide dismutase activity, content of malondialdehyde and lipofuscin in brains of mice were studied. The results showed that the exopolysaccharide extract inhibited superoxide anion by 43.06% at 2 mg/mL, scavenged hydroxyl radical by 72.4% at 1 mg/mL and ABTS free radical by 77.43% at 0.1 mg/mL. And at 50 mg/(kg·d) of the extract, SOD activities of male and female mice were increased by 20.70% and 21.13% respectively, while contents of LF and MDA were decreased 35.14% and 46.93%, 15.10% and 15.61%. It suggests that the exopolysaccharide extract fromM.conicahas obviously antioxidative and antiaging effects,and had gender differences on the antiaging effects, expressing a superior effect on female mice.

2010-09-19

广州市科技计划项目(2007Z3-E0421)；广东省部产学研结合项目(2009B090300298)；华南师范大学国家大学生创新性实验计划项目(091057425).

*通讯作者,zhangs@scnu.edu.cn

1000-5463(2011)02-0124-05

S646

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