基于负二阶导数红外光谱的反式脂肪酸的快速测定

陶 健 丁太春 冯 波 蒋炜丽 杨智灵 苏 亮

(河南省产品质量监督检验院国家粮油及肉制品质量监督检验中心，郑州 450004)

基于负二阶导数红外光谱的反式脂肪酸的快速测定

陶 健 丁太春 冯 波 蒋炜丽 杨智灵 苏 亮

(河南省产品质量监督检验院国家粮油及肉制品质量监督检验中心，郑州 450004)

建立了基于负二阶导数红外光谱的反式脂肪酸的快速测定方法。以三反油酸甘油酯和三油酸甘油酯混合标样系列为校正集，使用带有水平衰减全反射(HATR)附件的傅里叶变换红外光谱仪采集校正集样品在1 050～900 cm－1波段范围的吸收光谱，求二阶导数，乘以－10 000，得负二阶导数谱(－2D－HATRFTIR)。以970～960 cm－1波段范围的最大峰高为X轴，以三反油酸甘油酯含量为Y轴，构建定标方程为Y=0.348 8X－0.918 5，相关系数0.999 5。在0.5%～60%范围，验证集样品反式脂肪酸含量预测值与实际指定值显著相关，验证相关系数0.999 0，相对残差的绝对值小于10%，表明方法定标模型预测性能良好。方法检测下限达0.5%，改善了现有红外光谱法的灵敏度，适用于较低含量反式脂肪酸的快速测定。

反式脂肪酸 傅里叶变换红外光谱 水平衰减全反射 负二阶导数

在反式脂肪酸对人身健康的危害不断被发现、多国政府先后立法限制反式脂肪酸以及全社会共同关注的背景下，反式脂肪酸的测定成为研究热点，其中红外光谱法发展迅速，日益完善，有望实现反式脂肪酸快速准确的测定。反式脂肪酸分子结构中孤立反式双键在966 cm－1处表现特征吸收，吸收强度与反式双键的多少在一定范围内符合比尔定律，此为红外光谱法定量反式脂肪酸的基本原理。与气相色谱法相比，红外光谱法的优点是快速简单，最大的缺点是灵敏度低［1－3］。纵观红外光谱法的发展历程，操作简单化和提高灵敏度是贯穿始终的主导思想。从传统的 AOAC 965.34、AOAC 994.14 和 AOCS Cd 14 －95 到 AOAC 2000.10 和 ISO 13884:2003［4－8］，操作程序越来越简单，分析速度越来越快，但测定下限从未低于 5%，AOCS Cd 14d－99［9］要求以与样品脂肪酸组成一致并且不含反式脂肪酸的油样作为参比，但理想的参比油样很难获得，实际测定下限远高于1%的理论检出限。本文在相关研究的基础上［10－11］，构建一种新的基于负二阶导数红外光谱的反式脂肪酸的快速测定方法，改善了现有红外光谱法的灵敏度，适合于测定较低含量的反式脂肪酸。

1 材料与方法

1.1 试剂

三油酸甘油酯标准品:美国sigma公司;三反油酸甘油酯标准品:美国Nu Check公司。

1.2 仪器与设备

Spectrum One傅里叶变换红外光谱仪:Perkin Elmer公司，配备HATR附件(ZnSe晶体材料)和DTGS检测器;AG285电子天平:Mettler Toledo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 校正集样品的制备

准确称取三反油酸甘油酯(X g)和三油酸甘油酯［(0.3－X)g］于5 mL烧杯中，60℃水浴加热，混合均匀，其中 X 分别为 0.000 00，0.001 50，0.003 00，0.006 00，0.009 00，0.015 00，0.030 00，0.060 00，0.120 00，0.150 00，0.180 00，配制成三反油酸甘油酯质量分数别为0%，0.5%，1%，2%，3%，5%，10%，20%，40%，50%，60%的校正集样品。

1.3.2 校正集样品光谱的采集及数学处理

依次吸取适量制备好的校正集样品，加到HATR附件的ZnSe晶体上，使样品覆盖整个晶体表面，立即采集其在1 050～900 cm－1波段范围的水平衰减全反射傅里叶变换红外吸收光谱(HATR－FTIR)。对光谱求二阶导数，然后乘以－10 000，得到负二阶导数光谱(－2D－HATR－FTIR)。

1.3.3 构建标定方程

以校正集样品三反油酸甘油酯含量为Y轴，以970 cm～960 cm－1波段范围内对应的最大峰高为X轴，构建一元线性回归定标方程。

1.3.4 定标方程的验证

选择11份已知反式脂肪酸含量的样品为验证集，按照与校正集样品相同的方式采集和处理光谱，应用定标模型预测样品反式脂肪酸含量，然后通过预测值与实际指定值的相关性分析和残差分析对定标方程进行验证。

1.4 数据处理

采用红外光谱仪Spectrum v 6.3.5工作站及Microsoft Excel进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 三反油酸甘油酯的红外吸收光谱

三反油酸甘油酯在1 050～900 cm－1波段范围的水平衰减全反射傅里叶变换红外吸收情况见图1。由于孤立反式双键中CH官能团的平面振动变形，反式脂肪酸在966 cm－1处表现特征吸收，吸收强度与其在样品中的含量相关，吸收特性与脂肪酸碳链的长短和反式双键的位置无关。同时，脂肪酸分子结构中羧基在该波段范围存在干扰吸收，严重倾斜的谱图基线直接影响测定的准确性，尤其是对于反式脂肪酸质量分数较低(≤5%)的样品，特征吸收峰不再明显，定量测定相当困难。这是造成目前红外光谱法灵敏度不高的重要原因。

图1 三反油酸甘油酯的水平衰减全反射傅里叶变换红外吸收光谱

三反油酸甘油酯的负二阶导数光谱见图2。经过求负二阶导数数学处理，基线由倾斜变为水平，脂肪酸分子结构中羧基的干扰吸收现象在谱图上得到校正，可直接以空气为参比进行反式脂肪酸的测定，无需参比油样;反式脂肪酸分子结构中的孤立反式双键在966 cm－1处的特征吸收峰得以凸显，吸收谱带明显变窄，强化了光谱特征，提高了分辨率，有利于识别和消除共轭脂肪酸和饱和脂肪酸等造成的邻近966 cm－1的光谱吸收干扰。从而有效提升方法灵敏度。

图2 三反油酸甘油酯的负二阶导数水平衰减全反射傅里叶变换红外吸收光谱

2.2 定标方程

基于负二阶导数光谱构建的反式脂肪酸的定标曲线见图3。定标方程为Y=0.348 8X －0.918 5，线性相关系数0.999 5。结果表明，在0.5%～60%范围内，验证集样品的反式脂肪酸含量与对应的吸收强度(峰高)成正比，符合比尔定律。

图3 反式脂肪酸定标曲线(峰高对反式脂肪酸含量)

2.3 样品预测相关性分析

对于一个好的定标模型，理想的定标信息和参数固然重要，更重要的是具备精准的预测性能。11份验证集样品反式脂肪酸含量预测情况见表1，以实际指定值为X轴，以预测值为Y轴，对验证集样品反式脂肪酸含量的预测值与实际指定值进行一元线性相关回归分析的结果见图4，相关系数0.999 0。可见，预测值与实际指定值显著线性相关，表明定标方程预测性能良好。

表1 验证集样品反式脂肪酸含量预测和残差分析

图4 验证集样品反式脂肪酸含量预测值与实际指定值的相关性分析

2.4 样品预测残差分析

对验证集样品反式脂肪酸含量的预测情况进行残差分析，数据结果见表1。残差是实际指定值与预测值的差值，反映了预测值与实际指定值在数值和方向上的偏离情况，残差分布见图5。

图5 验证集样品反式脂肪酸含量预测值与实际指定值的残差分布

为更加直观的表征预测值与实际指定值的偏离程度，进一步进行相对残差分析，结果见图6。可见，当验证集样品反式脂肪酸质量分数大于10%，相对残差的绝对值小于5%;当验证集样品反式脂肪酸质量分数在0.5%～10%，相对残差的绝对值小于10%。残差分析进一步验证了定标模型可靠的预测性能。

图6 验证集样品反式脂肪酸含量预测值与实际指定值的相对残差分布

3 结论

建立了基于负二阶导数水平衰减全反射傅里叶变换红外光谱的反式脂肪酸的快速测定方法。当样品反式脂肪酸质量分数在0.5%～60%，定标模型预测性能良好。与传统的红外光谱法相比，负二阶导数法操作简便，直接以空气为背景采集光谱，无需参比油样;光谱特征增强，分辨率大大提升，能有效识别和消除共轭脂肪酸和饱和脂肪酸等产生的光谱干扰。更具意义的是，当今国际上食品中反式脂肪酸限量标准多在1% ～5%，正好落在负二阶导数法的测定下限以上，突破了传统红外光谱法因为只能测定食品中高含量(质量分数大于5%)反式脂肪酸而难以广泛应用中的尴尬局面。可见，负二阶导数法非常适合于食品中较低含量(质量分数小于5%)反式脂肪酸的快速测定，在日益严峻的食品安全监测领域的应用前景不可估量。

［1］AOCS official method Ce 1h －05.Determination of cis－，trans－，saturated，monounsaturated and polyunsaturated fatty acids in vegetable or non－ruminant animal oils and fats by capillary GLC［S］

［2］Mossoba M M，Milosevic V，Milosevic M，et al.Determination of total trans fats and oils by infrared spectroscopy for regulatory compliance［J］.Analytical Bioanalytical Chemistry，2007，389(1):87 －92

［3］Milosevic M，Milosevic V，Kramer J K G，et al.Determining low levels of trans fatty acids in foods using an improved ATR － FTIR procedure［J］.Lipid Technology，2004，16(11):252－255

［4］AOAC official method 965.34.Isolated trans isomers in margarines and shortenings infrared spectrometric method［S］

［5］AOAC official method 994.14.Isolated trans unsaturated fatty acid content in partially hydrogenated fats infrared spectrophotometric method［S］

［6］AOCS official method Cd 14 －95.Isolated trans isomers infrared spectrometric method［S］

［7］AOAC official method 2000.10.Determination of total isolated trans unsaturated fatty acids in fats and oils ATR－FTIR spectroscopy［S］

［8］ISO 13884:2003.Animal and vegetable fats and oils－ Determination of isolated trans isomers by infrared spectrometry［S］

［9］AOCS official method Cd 14d －99.Rapid determination of isolated trans geometric isomers in fats and oils by attenuated total reflection infrared spectroscopy［S］

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Rapid Determination of Trans Fatty Acids by Negative Second Derivative Horizontal Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Tao Jian Ding Taichun Feng Bo Jiang Yili Yang Zhiling Su Liang
(Henan Institute of Product Quality Inspection and Supervision，National Grain Oil＆ Meat－food Product Supervision and Inspection Center，Zhengzhou 450004)

A rapid method was developed to determine trans fatty acids in foods using negative second derivative horizontal attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy(－2D－HATR－FTIR).Mixtures of trielaidin and triolaidin were prepared as a calibration set，the spectra in the region from 1 050 to 900 cm－1was collected by the Fourier transform infrared spectroscopy with HATR accessory，to obtain a second derivative procedure，which was then multiplied with －10 000.Calibration plot and regression equation of－2D－HATR－FTIR band heights versus TFAs were obtained as(Y=0.348 8X － 0.918 5)，with the correlation coefficient of 0.999 5，which was thereafter validated by a validation set.Predicted concentrations were significantly correlated with specified concentrations for the TFAs levels in validation set samples at the TFAs levels from 0.5%to 60%.The correlation coefficient reached 0.999 5，while the relative residual was below 10%.It was suggested that calibration model predicted the TFAs levels in samples accurately.The enhanced spectral features of a negative second derivative resolved issues that traditionally limited the sensitivity of the previous infrared methodology.Low levels of TFAs in foods could be rapidly determined with the present method.

trans fatty acids，Fourier transform infrared spectroscopy，horizontal attenuated total reflection，negative second derivative

TS207.3

A

1003－0174(2011)11－0115－04

国家质检总局科技计划(2010QK115)，河南省科技攻关项目(082109006000)

2010－12－01

陶健，男，1978年出生，工程师，食品科学