酶法制备花生多肽工艺条件优化的研究

马 涛 刘德明

(沈阳农业大学食品学院1，沈阳 110866)

(辽宁省农业科学院食品与加工研究所2，沈阳 110161)

酶法制备花生多肽工艺条件优化的研究

马 涛1，2刘德明1

(沈阳农业大学食品学院1，沈阳 110866)

(辽宁省农业科学院食品与加工研究所2，沈阳 110161)

采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解花生粕中的蛋白质，制取抗氧化活性较高的花生多肽，以水解度(DH)和羟自由基清除率(E)为指标，确定了最佳用酶为碱性蛋白酶。考察了底物质量分数、加酶量、时间、温度和pH值5个因素对水解度(DH)和羟自由基清除率(E)的影响，采用单因素试验和响应面分析的方法确定了花生粕酶解制备花生多肽最佳工艺参数，条件为:底物质量分数8%、加酶量8 070 U/g底物，pH 7.7，温度55℃、时间3 h，该条件下得到的花生多肽羟自由基清除率为62.15%。

花生多肽 酶水解 抗氧化 优化

花生粕作为压榨花生油的一种副产物，产量大，来源广，价格低，且其中含有30% ～50%的花生蛋白质［1］。目前，我国大部分花生粕作为饲料使用，有的甚至作为废料丢弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。开发花生粕提取花生多肽，原料价格较低，符合节约型经济发展的需求。

根据前人的研究表明，花生多肽含有许多活性物质，含有人体所必需的8种氨基酸，尤其是硫氨酸的含量相当高，总氮量高达14.8%［2］，其稳定性、溶解性都优于花生蛋白［3］。动物试验表明，小分子肽具有极低的过敏性，可促进脂肪代谢，增强肌肉运动力，加速肌红细胞恢复，具有良好的吸湿性和保湿性，能促进双歧杆菌的增长代谢，并且具有独特的生理活性，可起到镇痛，调节体温、血压、脉搏，促进钙离子吸收，增强免疫力等作用［4－5］，能有效降低血清的总胆固醇，提高高密度脂蛋白含量［6－7］，而这些作用都与其抗氧化活性有关。

花生多肽是冷轧花生粕经适度水解后，分离得到的具有生物活性的肽，其中含有很多小肽，这些小肽易被人体消化和吸收，无毒副作用;但是如果水解过度，则会产生过多的游离氨基酸，口服后在肠道内因高渗引起腹泻［8］。所以，通过选择蛋白酶的最佳作用条件，控制水解程度和酶解物的羟自由基清除率，可得到抗氧化活性较高的花生多肽。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

冷轧花生粕(蛋白质质量分数为38.8%，水分质量分数为6%):辽宁宏圣花生股份有限公司。

碱性蛋白酶(200 000 U/g)、中性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(800 000 U/g)、风味蛋白酶(40 000 U/g):广西南宁庞博生物工程有限公司;盐酸:北京化学试剂有限公司;氢氧化钠:北京化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

YP3001N电子天平:上海光正医疗仪器有限公司;PHS－3C精密pH剂:上海日岛科学仪器有限公司;CS501－SP恒温磁力搅拌器:江苏中大仪器厂;LXJ－ILB离心机:上海精宏实验设备有限公司;UV120紫外可见分光光度计:尤尼科(上海)仪器有限公司;DHG－9053A数显鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冷轧花生粕的酶解工艺［9］

按一定底物质量分数准确称取冷轧花生粕粉于反应器中，加入适量蒸馏水，轻微搅拌至底物均匀分散于水中。然后在90℃下加热10 min，冷却到酶解反应温度后，用1.0 mol/L NaOH调节酸碱度至所需要的pH，依据所用的酶活力单位，准确称取蛋白酶后加入水解反应器，并慢慢搅拌。反应过程中及时滴加1.0 mol/L NaOH使系统稳定在最适pH。反应到预定时间，即停止加热搅拌，用1.0 mol/L HCl调节pH至4.5，迅速升温到80℃，加热10 min，钝化蛋白酶。记录水解过程中消耗的碱液量，并以此计算水解度DH。

1.3.2 水解度(DH)的测定:

采用 pH － Stat法［10，11］。按下式计算:

DH=(V×c)/(α×m×n)×100%

式中:V为碱液体积/L;c为碱液浓度/mol/L;α为氨基的解离度;m为底物中蛋白质总量/g;n为底物中蛋白质肽键总数，对花生蛋白而言，n=7.13(根据花生蛋白的氨基酸组成得到)。

1.3.3 花生多肽体外抗氧化活性的测定方法

以体外清除羟自由基·OH－做为花生多肽体外抗氧化测定方法:根据文献报道的方法稍加改进建立·OH－产生模型［12－13］。样品对羟自由基的清除率(E)按下式计算:

式中:A样品为样品的吸光度值;A空白对照为空白对照组的吸光度值;A0为空白组的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 酶的种类的筛选

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶水解冷轧花生粕，酶解的反应条件按照蛋白酶推荐最适条件进行，见表1。

表1 蛋白酶水解的最适pH和温度

水解过程中维持反应溶液的pH值和温度恒定，从反应开始每间隔40 min取一次样，灭酶后测DH，结果见图1。

图1 蛋白酶的水解进程曲线

由图1可以看出，风味蛋白酶对花生蛋白的水解能力最差，而通过对标准底物酪蛋白作为底物的酶活测定表明，其酶活力较高，这说明从专一性来说，花生蛋白是风味蛋白酶的不良底物。木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解能力比较接近。在所使用的4种蛋白酶中，碱性蛋白酶的水解能力最强。

因各种蛋白酶的底物特异性及作用位点的差异，不同蛋白酶作用于花生蛋白得到的酶解产物的肽链结构和长度是不同的，其活性也不同。通常期望得到一定功能的活性肽往往是分子质量较小的肽，单纯的追求高水解度，会产生较多游离氨基酸，因此仅用水解度为检测指标来确定制备抗氧化活性较高的花生多肽的最适酶种及确定酶解最优工艺条件是不适合的，应该以酶解物的生物活性大小作为检测指标，因此考察几种蛋白酶水解物体外抗氧化作用。

表2比较的不同蛋白酶水解物对羟自由基·OH－的清除作用。从表2中可以看出，虽然4种蛋白酶的水解物都有体外抗氧化作用，但是对羟自由基的清除作用有较大差异，其中碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物抗氧化作用较强［14］。

表2 不同蛋白酶水解物的体外抗氧化活性

由图1和表2可以看出在4种蛋白酶中，碱性蛋白酶的水解能力最强，酶解物的抗氧化活性最高，而且价格较低，所以本试验选用碱性蛋白酶为水解用酶。

2.2 加酶量对水解度及抗氧化活性的影响

配制底物质量分数为5%的花生粕溶液，反应温度为55℃，反应时间为3 h，分别按酶和底物之比为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 加入不同量的酶进行酶解。如图2所示，水解度随加酶量的增加而提高，底物的水解度取决于蛋白酶的浓度，只有当酶分子在体系中趋于饱和后，部分酶分子不能和底物接触时，水解度的提高才会减慢。当加酶量为10 000 U/g底物时，水解度基本上已经保持不变。抗氧化活性也随着加酶量的增加而提高，当加酶量为8 000 U/g底物时羟自由基清除率达到最大。随着加酶量的增加，水解度在不段增加，水解物分子质量分布范围就越小，因较高的氧化性只在一定的分子质量范围之内，水解不足或者过度水解会造成水解物抗氧化活性较低。

图2 蛋白酶浓度对水解度和羟自由基清除率的影响

2.3 不同pH对水解度和抗氧化活性的影响

在加酶量为8 000 U/g底物，反应温度为55℃，反应时间为3 h，底物质量分数为5%时选用不同的pH进行水解，结果如图3所示。由图3可知，在pH为8时，所得的花生多肽有较高的水解度。在pH为8时，所得水解物羟自由基的清除率也是最高，因此pH 8为蛋白酶作用的最适pH。酶分子是种特殊的蛋白质分子，由一个或者若干个活性部位组成。酶的活性部位只有与蛋白酶保持一定的空间构象才能存在，其催化功能才能实现，活性部位对反应体系的pH变化比较敏感，其解离状态随pH值的变化而变化。作为反应底物的花生蛋白随着pH的变化也表现出不同解离状态，因此，pH直接影响了酶与底物蛋白的结合和催化。

图3 pH对水解度和清除率的影响

2.4 不同酶解温度对水解度及抗氧化活性的影响

在底物质量分数为5%，加酶量为8 000 U/g底物，pH为8，反应时间为3 h的条件下，选择不同的温度进行水解。各种催化反应都有最适温度，酶催化反应在酶蛋白热稳定性层面和化学反应速度层面起作用。如图4所示，温度对水解度的影响不是很显著，在温度40～60℃范围内，水解度的变化很小，羟自由基清除率变化较大，在温度为55℃时水解物的抗氧化活性最高，所以选取55℃为最佳反应温度。

图4 水解温度对水解度和清楚率的影响

2.5 不同水解时间对水解物及抗氧化活性的影响

加酶量为8 000 U/g底物，pH为8，反应温度为55℃，底物质量分数为5%的条件下选择不同的水解时间进行水解度和抗氧化活性的测定，结果如图5所示，随水解时间的增加水解度不断增加，当时间达到3 h时，水解度基本上已经趋于稳定变化不是很大，抗氧化活性和水解度水解前期变化趋势保持一致，当水解时间达到3 h时活性达到最高，随后随时间增加抗氧化活性降低。原因可能是，蛋白酶水解蛋白质是逐步水解的，当蛋白酶和底物都是一定的条件下，蛋白质被水解为较小的肽段，随水解的进行，蛋白质中具有强自由基清除率的肽段被水解下来，然后进一步被水解，导致部分抗氧化活性消失。因此选择水解时间3 h为最佳水解时间。

图5 水解时间对水解度和清除率的影响

2.6 不同底物质量分数对水解度及抗氧化活性的影响

加酶量为8 000 U/g底物，pH为8，反应温度为55℃，反应时间为3 h，分别配制质量分数为2%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%的花生粕粉溶液进行酶解，结果如6所示。当底物质量分数为7.5%时，所得的花生多肽具有较高的水解度，对羟自由基的清除率也最大。根据酶解原理，底物质量分数较低时，底物不足以与所有的酶结合，一部分酶没有结合底物，没发挥催化作用。因此，产生的速度就随着底物质量分数的增加而增加，处于一级反应状态，生成的花生多肽就越多，羟自由基的清除率就越大。当所有酶都结合了底物时，即使底物再增加，反应速度达到饱和状态，处于零级反应状态。当底物质量分数大于7.5%时，花生粕分的流动性降低，抑制底物和酶的结合，因此反应速率大大降低。

图6 底物质量分数对水解度和清除率的影响

2.7 酶解工艺参数的优化

为了获得抗氧化活性较高的花生多肽，在单因素水平基础上，以加酶量、pH、底物质量分数为因素，花生粕水解物的羟自由基清除率为响应值，设计3因素3水平的二次回归方程来拟合因素和指标(响应值)之间的函数关系，采取响应面分析法(Response Surface Analysis，RSA)来寻求酶解最佳工艺参数［15］。试验的因素水平见表3，设计试验的结果见表4。

表3 Box－Behnken试验因素水平及其编码

表4 Box－Behnken试验设计表及其试验结果

上述每个试验均进行3次，对应的响应值取3次试验结果的平均值，试验数据使用Design－Expert软件进行二次回归分析，得到以下方程:

YDH=60.113 3+7.236 3A+8.433 8B+0.995 0C －11.352 9A2－9.637 9B2－ 11.180 4C2+0.347 5AB －4.865 0AC －4.610 0BC

其中A，B和C分别代表加酶量，底物质量分数和pH。通过进行方差分析来验证模型及各参数的显著度见表5。

表5 回归模型方差分析

由表5可以看出，回归方程的P＜0.01说明花生多肽制备所建立的二次多项模型具有高度显著性。模型相关系数R2为0.991 1＞0.9，说明该模型能解释99.11%的响应值的变化，拟合程度良好。失拟项的P=0.63不显著，说明模型中不需要引入更高次数的项，模型选择合适，可以用该模型代替试验点对试验结果进行分析和预测［16］。

回归方程的显著性见表6，结果表明，模型中的参数 A(加酶量)、B(底物质量分数)、C(pH)、AC，BC，A2，B2，C2都是显著的，对花生多肽的制备影响显著。

表6 回归方程系数显著性检验

为了进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点，通过Design－expert软件绘制响应面曲线来进行直观的分析，见图7至图9。分别显示了3组以清除率为响应值的趋势图，从曲面图可以直观的反映出两变量交互作用的显著度。

从以上分析可知，得到清除率预测值最大的条件:底物质量分数8.5%，加酶量8 070 U/g底物，pH 7.7，温度55℃、时间3 h，该条件下得到羟自由基清除率为63.33%的花生多肽。

在预测条件下对试验结果进行试验，得到花生多肽的羟自由基清除率为62.15%，与理论预测值基本吻合，这表明模型是合理有效的。

3 结论

通过试验可以得知，在所选的4种蛋白酶中，碱性蛋白酶的酶解物抗氧化活性最高，因此碱性蛋白酶为制备抗氧化活性较高的花生肽的最佳用酶，通过单因素试验和响应面分析，确定了碱性蛋白酶制备抗氧化活性较高的花生多肽的最佳酶解条件为:底物质量分数8%、加酶量8 070 U/g底物、pH 7.7、温度55℃、时间3 h，该条件下得到的羟自由基清除率为62.15%的花生多肽。

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Study on Process Condition Optimization for Preparation of Peanut Polypeptide by Enzyme Hydrolysis

Ma Tao1，2Liu Deming1
(College of food，Shenyang Agriculture University1，Shenyang 110866)
(Liaoning Academy of Agriculture Sciences，Food and Processing Institute，Shenyang 110161)

Alkaline protease，neutral protease，flavor protease and papain were used to hydrolyze peanut meal to prepare peanut polypeptides with higher antioxidant activity.With DH and E as the indices，alkaline protease was the best enzyme.Then，five factors，such as substrate concentration，proteases concentration，pH，temperature and time influence on DH and E，were investigated.Based on the results of one－factor－at－a－time－technique，a three－level Box－Behnken factorial design combining with response surface analysis(RSA)was employed to optimize the enzymatic hydrolyze condition of peanut polypeptides.The conditions were:substrate concentration 8.0%，proteases concentration 8 070 U/g per gram substrate，pH 7.7，temperature 55 ℃，and time 3.0 h.The peanut peptides scavenging rate on these conditions was 62.15%.

peanut polypeptides，enzymatic hydrolysis，antioxidant activity，optimization

TS221

A

1003－0174(2011)07－0089－06

2010－08－13

马涛，男，1962年出生，教授，博士生导师，粮油食品储藏保鲜与深加工

刘德明，女，1985年出生，硕士，食品科学