BMSCs移植对大鼠脑梗死后神经功能恢复及Nogo－A 表达的影响

郝 光 杨凤刚 冯念苹 金永华 梁松岚

脑梗死具有发病率、致残率和致死率均较高的特点，目前临床药物的治疗作用有限，人类一直在探索尝试其它的治疗方法。近年来，BMSCs移植治疗脑梗死成为相关研究人员努力的热点方向，动物实验显示移植治疗可改善神经功能缺损症状，亦有不少应用于临床的报道，但是BMSCs移植治疗脑梗死的确切机制仍然有待于完善。Nogo－A 是目前公认的神经轴突生长抑制因子，既往研究表明抑制Nogo－A 蛋白作用可促进神经再生［1］。因此，本研究从BMSCs移植治疗与脑梗死后神经再生的关系入手，观察移植后脑组织Nogo－A 表达水平的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM 培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone 公司）；TRIzol试剂（invitrogen公司）；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0［宝生物工程（大连）有限公司］；Nogo－A 兔抗多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；二氨基联苯胺（DAB）显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 实验动物及分组

细胞培养：健康SD 大鼠，体质量80～120 g，动物模型：健康雄性SD 大鼠，体质量220～280 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。将实验动物分为假手术组（sham 组）、模型对照组（MCAO 组）、溶剂对照组（Vehicle组）和移植组（BMSCs组），各组再按时间点分为3、7、14、21 d组，移植组3 d组12只，6只用于取材，6只用于观察BMSCs分布，其余各组6只。

1.3 局灶性脑缺血再灌注模型建立

采用改良Longa法［2］制备大鼠左侧大脑中动脉闭塞再灌注模型。用10%水合氯醛（0.35 ml／100 g）腹腔麻醉大鼠，在颈部正中略偏左行2.0～2.5 cm 纵向切口，暴露并小心分离出左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，线栓自颈总动脉剪口处插入颈内动脉，自颈动脉分叉处计算插线长度约18～20 mm。假手术组除不插入线栓外，其余过程同上。脑缺血2 h后轻轻抽出尼龙线至有阻力感，实施再灌注。按Zea－longa评分标准［2］对术后大鼠评分，0分：无神经缺损症状；1 分：不能伸展右侧前爪；2分：行走时向右侧转圈；3分：行走时向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失，1～3分者纳入实验。

1.4 神经功能缺损程度评分

评分观察者为非本试验组人员，在损伤后不同时间点参照Chen等［3］发表的改良神经功能缺损程度 评 分（modified neurological severity score，mNSS）方法，去掉了一些不易判断结果的项目，如深感觉检测、平衡试验等。所有大鼠在术后3、7、14、21 d分别进行评分。

1.5 BMSCs的分离与培养

脱颈处死大鼠，无菌操作取出双侧股骨、胫骨，暴露骨髓腔。用注射器抽取DMEM 培养液（含10%胎牛血清）冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞液，用200目无菌金属滤网过滤；以1×109个／L 的密度接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养；接种后48 h更换培养液，去除未贴壁细胞，此后每2 d更换培养液1次；培养10～14 d，以1∶2的比例传代培养；其后每2d更换培养液1次，每7～10 d传代1次。

1.6 BMSCs的标记与移植

收集第三代BMSCs，绿色荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记。BMSCs组经大鼠尾静脉注入3×109个／L BMSCs悬液1 mL，Vehicle组注入0.01 mol／L PBS 1 mL。

1.7 RT－PCR法测定Nogo－A 基因的表达水平

分别取各组大鼠脑损伤周边区组织（液氮冻存）20 mg，Trizol法提取总mRNA，以逆转录法翻译成cDNA，再进行PCR 扩增。

1.8 BMSCs在脑内分布的观察

移植3d组处死6只大鼠，迅速取出脑组织，立即放入液氮中，以视交叉为中心定位制成冰冻切片，丙酮固定5 min，倒置荧光显微镜下，用波长488 nm的激发光观察由CFSE 标记的BMSCs在移植大鼠脑内的存活及分布情况。

1.9 免疫组织化学染色

各组大鼠按相应时间点过量麻醉，左心室插管，先后灌注0.9%生理盐水、4%多聚甲醛溶液各100 mL内固定，然后断头取脑，置于超过标本体积10倍的4%多聚甲醛溶液中外固定至24 h，以视交叉为中心向前、后各取2 mm 厚的冠状位脑片，充分固定后常规脱水、透明、石蜡包埋、连续切片进行免疫组织化学染色，检测Nogo－A 蛋白的表达水平。Nogo－A 抗体滴度为1∶30。光学显微镜下观察，胞浆中有棕黄色颗粒的为阳性细胞。每张切片于梗死灶周围选择10个表达最强的视野，计数阳性细胞数后取平均值。

1.10 统计学处理

数据用均数±标准差表示，采用SAS 9.0软件，mNSS评分采用非参数检验比较，其余数据采用方差分析。P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结 果

2.1 BMSCs的分离与培养

原代培养的骨髓细胞接种第3 d，部分贴壁生长，多呈长梭形、三角形和多角形，即为BMSCs；第5 d开始，部分BMSCs形成集落；于第7～12 d开始呈指数增长，具有一定的方向性，呈束状或放射状排列；第14 d左右分布较散乱，单细胞数量多，细胞贴壁率达90% （图1）。传代培养的BMSCs形态多为长梭形，较原代细胞体积增大，增殖速度加快，贴壁能力增强，约7 d左右贴壁率达80%～90%（图1）。

2.2 BMSCs在脑组织中的分布

荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的BMSCs，并与周围组织很好整合（图2）。

图1 光学显微镜下原代培养14 d（A）及第三代（B）BMSCs（×100倍）

图2 荧光显微镜下移植BMSCs分布（CFSE×200倍）

2.3 大鼠行为学评分

BMSCs组在第7、14 和21 d mNSS 评分均低于MCAO 组和Vehicle组（P＜0.05）（表1）。

表1 各组不同时间点mNSS评分（±s，n＝6）

表1 各组不同时间点mNSS评分（±s，n＝6）

注：与MCAO 组比较，＃P＜0.05；与Vehicle组比较，＊P＜0.05

组别 mNSS 评分第3 d 第7 d 第14 d 第21d 63 Vehicle组3.50±0.55 2.83±0.75 2.33±0.52 2.00±0.63 BMSCs组3.33±0.52 1.83±0.41＃＊1.17±0.41＃＊1.17±0.41＃＊MCAO 组 3.67±0.52 2.83±0.75 2.17±0.75 2.00±0.

2.4 RT－PCR 法检测Nogo－A mRNA 的表达水平

Sham 组Nogo－A mRNA在各个时间点均呈较低水平表达，MCAO 组和Vehicle组于造模成功后第3 d Nogo－A mRNA表达水平增加，第7 d下降，第14 d达到高峰，第21 d有所下降，但仍然高于第3 d水平。MCAO 组 和Vehicle组 在 第3、14 和21 d Nogo－A mRNA的表达水平均高于Sham 组（P＜0.05）。BMSCs组Nogo－A mRNA的表达水平在第3、14和21 d均低于MCAO 组和Vehicle组（P＜0.05）。其中，BMSCs组在第14 d Nogo－A mRNA 的表达水平仍高于Sham 组（P＜0.05）（图3，表2）。

图3 各组Nogo－AmRNA 及β－actin RT－PCR凝胶电泳图像（A 为第3 d；B为第7 d：C为第14 d；D 为第21 d）

表2 各组不同时间点Nogo－A mRNA 相对表达量（±s，n＝6）

表2 各组不同时间点Nogo－A mRNA 相对表达量（±s，n＝6）

注：与Sham 组比较，＃P＜0.05；与MCAO 组比较，＊P＜0.05；与Vehicle组比较，△P＜0.05

组别 Nogo－A mRNA 相对表达量第3 d 第7 d 第14 d 第21d Sham 组 0.52±0.08 0.53±0.04 0.53±0.07 0.51±0.06 MCAO 组 0.65±0.07＃ 0.54±0.06 0.99±0.10＃ 0.76±0.09＃Vehicle组 0.64±0.08＃ 0.55±0.05 0.97±0.07＃ 0.76±0.10＃BMSCs组 0.53±0.06＊△0.49±0.04 0.72±0.07＃＊△0.60±0.07＊△

2.5 免疫组化法检测Nogo－A 的表达水平

Nogo－A 阳性染色主要在少突胶质细胞中表达，神经元中也有表达，大体成环状或半弧形分布。Sham 组各时间点损伤区周边白质中可见少量散在的Nogo－A 阳性细胞，MCAO 组和Vehicle组Nogo－A 阳性染色细胞数于造模成功后第3 d增加，第7 d有所减少，第14 d达到高峰，第21 d又减少，在第3、14和21 d时Nogo－A 阳性染色细胞数均高于Sham 组相应时间点（P＜0.05）。BMSCs组Nogo－A 阳性细胞数在第3、14和21 d均少于MCAO 组和Vehicle组（P＜0.05），其中，BMSCs 组第14 d Nogo－A 阳性染色细胞数仍高于Sham 组第14 d时的表达水平（P＜0.05）（表3，图4）。

表3 各组不同时间点Nogo－A 阳性细胞数比较（±s，n＝6）

表3 各组不同时间点Nogo－A 阳性细胞数比较（±s，n＝6）

注：与Sham 组比较，＃P＜0.05；与MCAO 组比较，＊P＜0.05；与Vehicle组比较△P＜0.05

组别 Nogo－A 阳性细胞数（个／每400视野）第3 d 第7 d 第14 d 第21d Sham 组 20.87±4.11 22.82±5.79 22.65±5.79 23.77±7.58 MCAO 组 31.02±3.85＃ 25.07±3.00 52.28±4.55＃ 39.60±5.84＃Vehicle组 31.90±3.03＃ 26.10±3.74 54.87±6.04＃ 39.00±4.90＃BMSCs组 24.97±4.20＊△21.93±2.68 40.77±6.68＃＊△30.38±3.86＊△

图4 光学显微镜下各组Nogo－A 表达水平（×400倍）（a为Sham 组；b为MCAO 组；c为Vehicle组；d为BMSCs组）

3 讨 论

脑梗死给脑组织造成了严重的损伤。在梗死灶中心区神经元及胶质细胞等死亡，而中枢神经再生能力弱，特别是神经元，属于永久性细胞，失有丝分裂能力，因此最终导致了永久的神经功能丧失。截至目前，公认的中枢神经再生困难的原因有两个，一是由于中枢神经系统本身再生能力微弱；再者是抑制性微环境阻碍了神经再生。形成抑制微环境的因子有Nogo－A、髓磷脂相关糖蛋白（MAG）、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）三种髓鞘源性蛋白，以及硫酸软骨素蛋白多糖Ephrins、信号素、Slits、神经生长因子、骨形态发生蛋白质和Wnts等［4］。Nogo－A 是Nogo基因编码的三种蛋白之一，是主要的髓鞘源性轴突再生抑制蛋白之一，主要由少突胶质细胞产生，在少突胶质细胞的胞浆和髓鞘中高表达，在一些神经元上也有表达，参与中枢神经系统损伤发生发展的全过程［5］。目前研究发现胞膜绑定的Nogo－A 分子有三个活性区域。首先，是Nogo－66域，是由66个氨基酸残基组成的亲水性袢环结构，位于Nogo－A 的C端，与受体NgR1结合，可抑制神经轴突的生长和诱导生长锥塌陷；其次是由Nogo－A 一个特殊外显子编码的区域，Oertle等研究证明此区域可以抑制轴突生长和3T3成纤维细胞伸展，并可诱导生长锥塌陷［6］；再者Nogo－A 的N 端存在一个称为amino－Nogo的结构域，可通过直接或间接的阻断结合素来阻断轴突生长和细胞粘附［7］。

干细胞移植治疗技术方兴未艾。大量的动物实验表明，BMSCs 移植可通过向神经细胞分化替代［8］、营养神经作用［9］、促进血管重建［10］等机制促进神经神功恢复。部分学者已大胆地进行了少量的临床应用研究，结果显示治疗有效，并未见到明显的不良反应［11，12］。但是BMSCs移植治疗中枢神经系统损伤的机制仍然不够全面和确切，典型损伤如脑梗死在不同时间不同移植途径下的作用机制不够清楚，特别是关于BMSCs移植和神经再生的关系研究不多。

本研究采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，培养至第3代后用CFSE 标记，然后经尾静脉移植到MCAO 模型大鼠体内。在脑缺血再灌注损伤后第3 d，在损伤周边区脑组织中观察到CFSE 染色的绿色阳性细胞，表明移植的BMSCs在第3 d已经能向受损部位迁移、募集、存活。mNSS评分结果显示，BMSCs组在第7、第14 和第21 d较MCAO 组和Vehicle组得分下降，且差异具有显著性，说明BMSCs移植能够促进脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能恢复。通过RT－PCR 和免疫组织化学染色发现在MCAO 组和Vehicle组的多个时间点Nogo－A表达量较Sham 组增加；其趋势为损伤后第3 d Nogo－A 的表达开始增加，第7 d下降至同Sham 组水平，第14 d达到高峰，第21 d又下降但仍高于第3 d水平，而BMSCs组损伤周边白质中Nogo－A 水平在第3、14、和21 d较MCAO 组和Vehicle组降低，且差异具有显著性，因此本研究推测出脑梗死后的一定时期内Nogo－A 的表达增加阻碍了神经功能的恢复，而BMSCs移植对Nogo－A 的表达水平有一定的抑制作用，在一定程度上解除了神经再生的瓶颈，使得神经功能得到较快的恢复。但本研究结果还显示，MCAO 组 和Vehicle组 在 第7 d 时Nogo－A 表达水平下降回到假手术组水平，这与国内部分学者的实验结果基本一致［13］。

综上所述，BMSCs移植治疗可促进大鼠脑梗死后的神经功能恢复，其作用机制可能与下调Nogo－A 的表达水平有关。但BMSCs移植后Nogo－A 表达下调的具体机制及两者在脑梗死后更长时期内的作用过程仍有待于探讨。

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