五莲黑猪IFN-γ基因克隆、序列分析及同源建模研究
王海洲 (山东省日照市畜牧站 276800) 丁永贵 (山东省平邑县畜牧兽医局)贾晓晖 (山东省日照市畜牧兽医局)
从GenBank/DDBJ/EMBL基因库中读取猪IFN-γ基因进行序列分析设计引物,基因组中克隆了IFN-γ基因序列并分析其基因组结构,运用生物信息学技术对测序结果进行分析,同源建模分析,发现该基因由氨基末端结构域和羧基末端结构域构成。
五莲黑猪 IFN-γ 基因组 同源建模
五莲黑猪属华北型猪,是山东省地方良种,该品种毛色纯黑、适应性强、耐粗饲、肉质优良、肉味鲜美、抗病力强生长速度快、产仔数高等特点,深受日照市五莲县及鲁南地区群众的喜爱,一度成为当地的当家品种,经济杂交优势明显,是生产瘦肉猪的良好母本。随着猪肉生产日益向着瘦肉方向的发展,瘦肉率与肉质间的负相关所造成的不利影响也明显地表现出来。据报导瘦肉率较高的品种或品系,应激敏感猪(PSS猪)较多,PSE(pale, soft&exudative)肉和DFD(dark, firm&dry)肉的发生率也较高,因而导致了猪肉品质的下降,严重地影响了肉的食用价值和经济价值,鉴于国外这种情况,研究和发掘我国地方品种,对于改良生猪性能具有重要的意义。
猪干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)是一种具有强烈抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子,主要由激活的T细胞和NK细胞产生,在机体免疫系统中发挥重要作用[1,2]。研究证实,IFN-γ作为生物药剂或疫苗佐剂具有安全、高效、无毒副作用等特点[3,4]。1990年Dijikmans等[5]首先克隆了含内含子的猪IFN-γ基因。随后,Vandenbroeck等[6]又分段克隆了猪IFN-γ基因的外显子并将其拼接为完整基因后进行了原核表达。此后不断有关于猪IFN-γ基因克隆和表达的报道[7,8]。为了研究和开发新型的疫苗佐剂和相关生物制剂,有效控制一些严重危害养猪业的传染病,本研究通过对猪外周血单个核细胞(PBMC)刺激诱导后,采用反转录-聚合酶链(RT-PCR)技术克隆了猪IFN-γ基因,并对其序列进行了初步分析。
1.1.1 菌株和质粒 转化态受体菌株为DH5α由本实验室保存,克隆载体为pMD-18T,购自Takara公司;
1.1.2 试验动物 50周龄五莲黑猪10头由日照港物业有限公司五莲黑猪保种基地提供;
1.1.3 引物设计 登录GenBank数据库,根据登录的猪(NM_214078.1)的IFN-γ基因序列,在其阅读框外侧用Oligo软件设计引物:上游引物5′-TCTCTCCGAAACAAT GAGTTA-3′,下游引物5′-TAATAGATACCCATTTTCATC ACA-3′,上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。
1.1.4 工具酶及试剂 RNA提取试剂盒、dNTP、LA-Taq酶、AMV反转录酶、DNA MakerDL2000、质粒纯化试剂盒购自Takara生物公司;琼脂糖、RNasin、氨苄青霉素、X-gal、IPTG购自华美生物工程公司;T4连接酶购自TOY-OBO生物公司;胰蛋白胨、酵母提取物为OXID产品。
1.2.1 总RNA的提取 取冻存的五莲黑猪肝脏组织在液氮中充分研磨,在液氮挥发完全之前用总RNA 抽提试剂盒,按照试剂盒操作手册进行总RNA的提取。用日本岛津生物仪器公司的DNA/RNA计算器和甲醛凝胶电泳检测RNA 质量。
1.2.2 五莲黑猪IFN-γ基因RT-PCR的扩增 以抽提的总RNA为模板,以Oligo dT为反转录引物,按照TOYOBO公司逆转录试剂盒操作手册进行cDNA第一链的合成。产物-20℃保存。
以cDNA为模板,扩增五莲黑猪IFN-γ基因。反应体系如下:10×PCR Buffer 2.5μl,dNTP 2ml,上、下游引物(10 pmol/μl) 各1μl,Taq酶0.3ml,cDNA模板1ml,加灭菌蒸馏水至25ml。PCR反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性1min、56℃退火40s、72℃延伸1min,35个循环;最后72℃延伸6min。PCR反应结束后,取10μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,以检查扩增结果。
1.2.3 重组质粒的构建转化及其鉴定 将扩增的PCR产物回收,与pMD-18T载体构建重组质粒,16℃连接过夜,转化利用CaCl2法制备的感受态细胞大肠杆菌DH5α,在Amp/X-gal/IPTG选择性LB固体培养基中筛选蓝白斑,选取白斑在液体LB培养基中摇菌12h。取1μl菌液,利用与1.2.2相同的条件做PCR鉴定。
1.2.4 测序 将新鲜菌液送Takara生物公司测序,ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle sequence Ready Reaction试剂盒和ABI PRISMTM 377XL测序仪,测通全序列。
1.2.5 测序结果分析 序列的同源性分析采用动态规划的方法,选用CLUSTALW软件分析,序列的电荷分布,疏水性,重复结构及周期性分析选用SAPS(Statistical Analysis of Protein Sequences)统计分析软件,局部序列的等电点采用ComputepI/MW程序计算。
搜索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的swiss pro Modeling建模服务器,通过所提交的序列信息在蛋白质结构库中搜寻模板,在swiss-pdb viewer中通过人工方法对局部结构进行调整,采用蛋白质三维图像软件Swiss-Pdb Viewer根据距离平方和最小的叠合方法(Least squares superposition),将蛋白质分子的结构进行叠合。
图1 五莲黑猪IFN-γ基因RT-PCR产物电泳分析
M:DNA Maker DL2000;
1:RT-PCR产物
图2 阳性克隆菌液的PCR产物的电泳分析
M:DNA Maker DL2000;
1,2:阳性克隆菌液的产物
根据设计的引物对五莲黑猪肝脏中的总RNA进行RT-PCR反应,结果如图1,扩增产物位于500~750bp之间。
将构建的重组质粒,转化到感受态细胞DH5α中,在Amp/X-gal/IPTG选择性LB固体培养基中筛选蓝白斑。取1μl阳性克隆的菌液进行PCR鉴定(如图3),初步证明克隆成功。
将鉴定后的重组克隆培养后由博亚公司进行序列测定。测定的结果表明,五莲黑猪IFN-γ基因cDNA为662bp,含一个完整的开放阅读框(ORF),共编码166个氨基酸。测得的序列及推导的氨基酸序列如图3。
图3 五莲黑猪IFN-γ基因cDNA序列及推知的氨基酸序列
通过距离平方和最小的叠合方法进行预测,得到五莲黑猪IFN-γ的空间结构,发现分子结构具有2个结构域:氨基末端结构域和羧基末端结构域。如图4。
图4 五莲黑猪IFN-γ蛋白同源建模分析图
首次测定和分析了五莲黑猪IFN-γ基因,分析证明这种基因的特征与其它物种IFN-γ基因的特征基本一致,在以后的实验中将继续进行有关五莲黑猪抗病性能、免疫和遗传方面的研究。(1)本研究中克隆的五莲黑猪的IFN-γ基因序列与Gen-Bank上登载的猪的序列基因基本一致,无变异,说明同一物种的IFN-γ基因具有极高的保守性。猪IFN-γ基因的开放阅读框编码由166个氨基酸组成的前体蛋白,成熟的猪IFN-γ含143个氨基酸残基,推测其分子质量为17ku。此外,不同物种之间具有很高的同源性,表明在部分物种之间IFN-γ在基因方面有着极高的相似性。(2)养猪业在我国国民经济中占据着相当重要的地位,但是猪的一些烈性传染病,尤其是病毒病严重威胁着养猪业的进一步发展。研究表明,IFN-γ是一种高活性、多功能的生物活性糖蛋白,具有强烈的免疫调节作用,对寄生在细胞内的各种病原体均具有抑制作用。无论作为疫苗佐剂或其他类型的生物制剂,IFN-γ均可明显提高机体抗感染能力。但在通常情况下,机体内IFN-γ表达量甚微,不可能直接提取纯化。因此,应用IFN-γ作为疫苗佐剂或抗病毒性药物,必须通过基因工程技术体外生产重组IFN-γ,本研究对五莲黑猪IFN-γ基因的克隆为此打下了基础。
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(2011–09–13)
S828.2
A
1007-1733(2011)12-0003-03