泥蚶血淋巴抗菌活性分析



泥蚶血淋巴抗菌活性分析

王雪鹏 张 鑫 张 玲 （山东农业大学动物科技学院 泰安 271018）缪宇平*（农业部海洋与河口渔业重点开放实验室中国水产科学研究院东海水产研究所 上海）

以泥蚶为试验材料，分别用活的和灭活的副溶血弧菌通过浸泡方式诱导其产生抗菌物质，并以副溶血弧菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌为指示菌进行抗菌活性测定。结果表明：(1)活的和灭活的副溶血弧菌诱导条件对泥蚶血淋巴的抗菌活性影响不显著(P>0.05)，但比对照组差异显著(P<0.05)；(2)血淋巴对副溶血弧菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有抑菌作用，尤其是副溶血弧菌和白色念珠菌。

泥蚶 血淋巴 抗菌活性

泥蚶，隶属于软体动物门、瓣鳃纲、列齿目、蚶科、泥蚶属，是一种栖息于沿海滩涂的广温性双壳贝类，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中国、韩国、泰国、菲律宾以及马来西亚等国家，在我国分布于山东半岛以南沿海，是山东、浙江、福建和广东等省重要的养殖经济贝类(王日昕等, 2005)。但随着养殖规模的不断扩大，泥蚶细菌病也频繁暴发，对泥蚶养殖业造成严重危害。近几十年来，很多报道证明抗生素是治疗细菌病的一种重要手段，然而又会引起水产品抗生素残留、细菌耐药性等问题。为了更好预防和控制细菌感染，必须发展一种生物方法(例如抗菌肽)来控制。

抗菌肽，也称为肽类抗生素，是一类小分子短肽，具有抗菌力强、抗菌谱广、活性稳定、可以中和细菌内毒素、很难产生耐药性等特点。抗菌肽是Boman等人在1981年首次从惜古比天蚕中发现的，命名为天蚕素。之后国内外许多研究者相继在其他生物如昆虫(Rees et al，1997)、哺乳动物(王莉莉等, 2004)、两栖动物(Lai et al，2002b)、植物(Asiegbu et al，2003)以及微生物(刘颍等, 1999)中均发现抗菌物质，表明抗菌肽广泛存在于细菌、植物、脊椎和无脊椎动物中，是先天免疫系统中的重要因子。至今报道的抗菌肽已经超过500种(洪旭光等, 2004)。

近10年对抗菌肽的研究已深入到分子结构、作用机制、基因的表达与调控等方面，但对贝类抗菌肽的研究却非常少，目前，泥蚶(Jianmin Zhao et al，2007)、贻贝(仲燕等, 2005)、牡蛎(M. Gonzalez et al，2007)等养殖贝类的某个抗菌肽及其生物学活性进行初步研究。本研究主要探讨活的和灭活的副溶血弧菌对泥蚶血淋巴抗菌物质的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物与菌株

试验动物：成年泥蚶，采自浙江温州海域，以洁净海水在通氧条件下养于恒温(18~20℃)水族箱。试验菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、和副溶血弧菌由浙江省海洋水产养殖研究所闫茂仓惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 副溶血弧菌诱导物的制备 试验菌株接种于ZoBell 2116E琼脂培养基斜面上，30℃培养24h，生理盐水洗下菌苔，2000r/min离心10min，去上清液，沉淀再用生理盐水洗3次，配成浓度为3×1011CFU/ml的菌悬液，0.1MPa灭菌20min或不灭菌，分别用于灭活菌和活菌免疫诱导。

1.2.2 试验设计及分组 成年泥蚶3000只，随机分成3组，A组用浓度为3×108CFU/ml灭活的副溶血弧菌处理，B组用浓度为3×108CFU/ml活的副溶血弧菌处理，C组不处理。

1.2.3 血淋巴的采集 分别在诱导处理后的第1、2、4、8、16和24h，用无菌注射器从供试贝类体内采集血淋巴，每组采集150只，血样混合后，5 000r/min低温(4℃)离心10min，取上清液，经0.22μm孔径无菌过滤器过滤备用。按同样方法从未经诱导处理的贝类体内采集血淋巴作为对照血淋巴。

1.2.4 抗菌活性测定 每毫升含106细菌的菌液100μl均匀涂布于固体细菌培养基表面，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加一定量的泥蚶血淋巴，于30℃培养10~20h，观察抑菌圈形成与否，并测定抑菌圈直径。

2 结果

血淋巴对副溶血弧菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌结果见表1。从表1得知，泥蚶在诱导前其血淋巴中含有对抑菌活性物质，经过诱导后对这两种菌的抑菌活性有明显的提高，诱导后16~24h后对指示菌的抑菌活性最强，其后一直保持较高的抑菌活性。活菌的诱导效果比灭活菌的诱导效果略好。

表1 诱导前后泥蚶血淋巴的抑菌活性比较 (mm)

3 讨论

魏玉西等报道，在软体动物中，缺乏抗体介导的免疫反应，因而它不能通过接种抗原来达到产生免疫抗体的自我保护的目的。但是，可以通过提高贝类的非特异免疫防御系统来增强贝类的抗病力。本试验中，通过诱导可使泥蚶血淋巴的抑菌活性增强，说明泥蚶的非特异性免疫因子存在一定程度的可诱导性。因此，在实际生产中，可通过适当的方法诱导泥蚶产生更强的抗病力。

目前，研究者发现贝类的抗菌物质主要有防御素、贻贝素、贻贝肽、贻贝霉素等多种抗菌物质，分别对革兰氏阳性、阴性菌、真菌等有抗菌效果。但与其它生物(如昆虫、哺乳动物、两栖动物、植物以及微生物)抗菌肽的研究相比，在种类和研究深度上还有很大差距。

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本课题由农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室开放基金资助(开-09-12)

（2011–11–19）

Q959.215

A

1007-1733(2011)12-0001-02