木槿花醇溶性色素的提取及其清除超氧自由基活性研究

耿明江 范秉琳 李琴等

摘要：测定了木槿花醇溶性色素在可见光区的最大吸收波长；在单因素试验的基础上，采用正交试验，以吸光度与浸提液总体积之积为指标，对提取温度、浸提时间、超声时间和料液比进行优选研究，采用邻苯三酚自氧化法考察该色素清除超氧自由基活性。结果显示最佳提取工艺条件为提取温度40℃，料液比1∶50（W/V，g∶mL），浸提时间1 h（包括超声时间45 min）；该色素具有一定的清除超氧自由基活性。

关键词：木槿花；醇溶性色素；正交试验；超氧自由基

中图分类号：Ｓ６８５．９９ 文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3378-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｔｈａｎｏｌ－ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｓｃａｖｅｎｇｅ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.

ＧＥＮＧ Ｍｉｎｇ－ｊｉａｎｇ１，ＦＡＮ Ｂｉｎｇ－ｌｉｎ１，ＬＩ Ｑｉｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｈｕａｉ－ｋｕｎ３

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ of Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Henan， Ｃｈｉｎａ； ２．Ａｎａｌｙｓｉｓ ＆ Ｔｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Henan， Ｃｈｉｎａ； ３．Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｗｅｉｈｕｉ ４５３１００，Henan， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ. ｗａｓ ｍｅｎｓｕｒａｔｅｄ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ （Ａ·Ｖ）， ａｍｏｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ temperature， ｓｏａｋｉｎｇ ｔｉｍｅ， ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌ－ｓｏｌｖｅｎｔ ｒａｔｉｏ． Ｔｈｅ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｖｅｎｇｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ was extracting temperature 40 ℃， material-solvent ratio 1∶50（W/V，g∶mL）， soaking time 1h（including ultrasonic time 45 min）， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｈａｓ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｖｅｎｇｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.； ｅｔｈａｎｏｌ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ

木槿（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.）屬于锦葵科木槿属落叶乔木，夏季满枝缀花，花朵大而艳丽，花、叶对ＳＯ２、ＮＯｘ具有较强的吸收性和耐受性［１］，因而被广泛用作庭院、街道的绿化植物。此外，木槿还是一种重要的药用植物，其根、皮、花、种子皆可入药［２，３］。Ｋｗｏｎ等［４］考察了热处理对木槿枝、根醇提取物抗氧化活性的影响。金月亭等［５］证实木槿花的乙醇研磨液具有一定的抑菌、促进凝血的活性。景立新等［６］从营养价值的角度对木槿花进行了研究。蒋新龙的研究小组先后对木槿花中的总黄酮［７］、红色素［８］的提取工艺进行了探讨。本试验以干燥粉碎的重瓣紫色木槿花花瓣为原料，对木槿花醇溶性色素的提取工艺及其清除超氧自由基活性进行研究，以期为木槿花色素的研究开发提供依据。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１木槿花木槿花于２０１０年８月采摘于河南省新乡市新中大道，花瓣经３５～４０ ℃鼓风干燥４８ ｈ，粉碎后避光保存备用。

１．１．２试剂维生素Ｃ，美国Sｉｇｍａ公司，其他所用试剂均为国产分析纯，使用前未进行任何纯化处理。除自由基活性测试过程中用水为二次蒸馏水外，其他检测用水均为去离子水。８６００２１大孔吸附树脂，山东鲁抗立科药物化学有限公司，使用前按说明书所示方法进行活化处理。

１．１．３仪器岛津ＵＶ２５５０紫外可见分光光度计，ＳＥＮＣＯ旋转蒸发器，１０１－３型电热鼓风恒温干燥箱，Ｓａｒｔｏｕｒｕｓ ＢＳ２４４ 电子分析天平，ＫＱ－１００ＤＢ型超声波清洗器，多功能粉碎机，恒温水浴锅，雷磁ＰＨＳ－３Ｂ型酸度计。

１．２方法

１．２．１色素的提取准确称取一定质量的木槿花瓣粉末于５０ ｍＬ具塞三角瓶中，加入溶剂，按一定的水浴温度、超声时间、浸提时间和料液比进行提取，冷却后过滤；然后向滤液中加入一定体积的９５％乙醇，使终体积分数约为８０％，将此液体以

４ ０００ ｒ／ｍｉｎ的速度离心５ ｍｉｎ，弃去沉淀，上清液经减压浓缩后得粗色素浸膏。

１．２．２色素的精制向色素浸膏中加入少量水，超声分散后，石油醚萃取２次；水相上８６００２１大孔吸附树脂柱，先用４倍柱体积的水洗后，再用９５％乙醇进行洗脱；将洗脱液减压蒸去乙醇，得紫黑色色素粉末。

１．２．３色素吸收光谱的测定取适量精制的色素粉末，用５０％乙醇溶解后得红色溶液。以等体积分数乙醇为参比，将此溶液在３００～８００ ｎｍ的波长范围内扫描，得其吸收曲线。

１．２．４单因素试验影响色素得率的因素较多，本试验主要从浸提温度、时间、超声时间和料液比等方面进行单因素试验。浸提温度选取２０、３０、４０、５０、６０℃ ５个水平，提取时间选取１、２、３、４、５ ｈ ５个水平，超声时间选取０、１５、３０、４５、６０ ｍｉｎ ５个水平，料液比选取１∶３０、１∶４０、１∶５０、１∶６０、１∶７０（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同）５个水平，分别进行试验。

１．２．５正交试验在单因素试验的基础之上，以提取液的吸光度（Ａ）与浸提液的总体积（V）之积为得率考察指标，采用Ｌ９（３４）正交表进行正交试验，因素与水平设计见表１。试验结果利用Ｏｒｉｇｉｎ ７．５进行方差分析，筛选出提取醇溶性色素的最佳条件，并对所得的最佳条件进行验证试验。

１．２．６体外清除超氧自由基活性试验根据许申鸿等［９］所述方法稍加改变。在４ ｍＬ反应混合物中含有Ｔｒｉs－ＨＣｌ缓冲溶液（ｐＨ值为８．２）３．４ ｍＬ、２０

ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ水溶液０．２ ｍＬ、不同含量的精制色素水溶液０．２ ｍＬ、５ ｍｍｏｌ／Ｌ的邻苯三酚０．２ ｍＬ。先将混合物于２５℃保温２０ ｍｉｎ， 再加入等温的邻苯三酚溶液；加入后立即摇匀，准确反应４ ｍｉｎ，立即在４２０ ｎｍ波长处测定其吸光度Ａｉ。同时设立自身组（Ａｉ′）和控制组（Ａ０），分别以等体积的水代替邻苯三酚或色素，并以维生素Ｃ为正的对照试验。清除率（％）＝［１－（Ａｉ＋Ａｉ′）／Ａ０］×１００。

２结果与分析

２．１木槿花醇溶性色素的光谱特征

从图１可知醇溶性色素在可见光区内有一个较明显的吸收，其最大吸收峰位于５３４ ｎｍ处。故本试验均以５３４ ｎｍ作为检测波长。

２．２单因素试验

将０．５ ｇ木槿花瓣粉末分别溶于一定体积分数的乙醇中，控制其他因素，考察改变某单一因素时对醇溶性色素A·V值的影响（图２）。由图２可知，当料液比为１∶４０、超声预处理３０ ｍｉｎ、浸提时间为２ ｈ时，醇溶性色素的A·V值在２０～６０ ℃范围内随着提取温度的升高，A·V值相应增大；当温度超过５０ ℃时，温度对色素A·V值的影响变小，因此以５０ ℃为提取温度较为合适。当固定料液比１∶４０、超声预处理３０ ｍｉｎ、（５０±１）℃恒温条件下，改变浸提时间，醇溶性色素的A·V值随浸提时间的增加而增大；但当浸提时间达到３ ｈ后，浸提时间的延长对色素A·V值的影响不大。当固定料液比１∶４０、５０ ℃恒温、浸提时间共计２ ｈ时，超声处理时间对醇溶性色素的A·V值影响较为明显，并且随着超声处理时间的延长，色素的A·V值会相应增加；但当超过４５ ｍｉｎ后，增幅变缓。当超声预处理３０ ｍｉｎ、总提取时间为２ ｈ、提取温度保持在（５０±１）℃时，随料液比的改变色素的A·V值发生相应的变化，考虑到料液比过大会使后面的沉淀、离心、浓缩等工作量增大，且耗费更多的乙醇和热能，因此料液比为１∶４０～１∶６０较为合适。

２．３正交试验结果

在单因素试验的基础上，对上述各因素选定３个水平，以浸提液的吸光度（Ａ）与浸提液的总体积（Ｖ）之积（Ａ·Ｖ）为得率考察指标，设计正交试验。其正交试验结果见表２。由表２结果可知，Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，即影响木槿花色素提取效果的各因素主次顺序为：超声时间＞料液比＞提取温度＞浸提时间。

由方差分析结果可知，除浸提时间外，其他各因素均对色素的提取效果有显著性差异。根据表２可知最佳工艺条件为Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２，但考虑到在４０、５０ ℃时提取效果增加不明显，而温度越高所消耗的能源就越多，从节约能源角度综合考虑，提取色素最佳工艺条件定为Ａ３Ｂ１Ｃ2Ｄ２，即在４０ ℃条件下，按

１∶５０的料液比混合后先超声处理４５ ｍｉｎ，然后再浸取1５ ｍｉｎ。

２．４验证试验

准确称取０．５ ｇ干燥木槿花花瓣粉末，按上述所得最佳工艺条件进行验证试验，醇溶性色素的A·V值分别为１３．５５０、１３．６００、１３．４７５，平均A·V值為１３．５４２。

２．5木槿花色素对超氧自由基的清除作用

从表３可以看出，木槿花色素具有一定的清除超氧自由基活性，并且这种活性随着色素浓度的升高而增强，表明它们间存在一定的量效关系。但对比ＶC的清除活性可知，在等浓度条件下该色素活性比ＶC要弱得多，色素对超氧自由基清除率达５０％时所需浓度（ＥＣ５０）大于１０ ｇ／Ｌ（清除率为４０．３％），而ＶC的ＥＣ５０小于０．４ ｇ／Ｌ（消除率为６７．８％）。因此该色素并不是一种很强的清除超氧自由基活性物质。

３结论

影响木槿花色素得率的因素依次为：超声时间、料液比、提取温度和浸提时间，最佳提取工艺条件是：温度４０℃、料液比１∶５０、提取时间1 ｈ（包括超声处理４５ ｍｉｎ）。3次平行验证试验间的相对标准偏差为０．４３３％，说明该工艺条件稳定可行。木槿花色素具有一定清除超氧自由基的活性，并且其清除能力与浓度存在量效关系。

参考文献：

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