水飞蓟粕蛋白的酶解及其酶解物抗氧化活性研究

朱淑云 董 英 张海晖 李希晶

(江苏大学食品与生物工程学院,镇江 212013)

水飞蓟粕蛋白的酶解及其酶解物抗氧化活性研究

朱淑云 董 英 张海晖 李希晶

(江苏大学食品与生物工程学院,镇江 212013)

以水飞蓟粕为原料,研究其蛋白酶解工艺及酶解物的抗氧化活性。结果表明,中性蛋白酶用于制备水飞蓟粕蛋白抗氧化肽具有明显的优势。正交试验确定了制备水飞蓟粕蛋白抗氧化肽的最佳酶解条件为:底物质量分数 2%,加酶量 14 000 U/g,pH 7.0,温度 55℃,酶解时间 120 min,该条件下制备的水飞蓟粕蛋白酶解物对羟自由基的清除率为 88.57%。抗氧化试验显示,水飞蓟粕蛋白酶解物具有一定的清除 DPPH自由基和羟自由基能力,IC50分别为 0.402 g/L和 6.659 g/L,水飞蓟粕蛋白酶解物同样也具有较强的还原能力。

水飞蓟粕 蛋白酶 酶解工艺 抗氧化

研究证明,自由基的氧化损伤与许多疾病的发病机理有关[1-3]。人体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平,防止脂质过氧化,帮助机体抵御疾病[4-6]。生物活性肽是一类具有高度生物活性的物质,其抗氧化性显著,它是蛋白质经特殊蛋白酶酶解或生物降解后产生的数个或数十个氨基酸组成的肽类混合物,其结构特殊,与氨基酸、大分子蛋白质等物质相比,具有极强的活性和多样性,且食用安全性更高[7]。不同原料中的肽含量不同,寻找蛋白含量较高的天然产物来获取活性较强抗氧化肽,引起了各国科学家的普遍关注。

水飞蓟 (S ilibum m arianumGrertn)为菊科水飞蓟属一、二年生草本植物,原产于地中海沿岸,现广泛分布于欧洲、北美洲、亚洲、非洲和南美洲,我国陕西、黑龙江、辽宁、江苏、北京、湖北等地均有栽培,2004年我国水飞蓟籽总产量 2万吨以上。近年来国内对水飞蓟资源的利用大都以提取水飞蓟素为主,其副产品水飞蓟粕一般用作饲料或肥料,利用的附加值较低。水飞蓟粕中蛋白质含量较高,氨基酸种类齐全,是一种潜力巨大的植物蛋白资源[8]。以植物蛋白为原料采用酶解方法制备生物活性肽已广为应用[9],目前有关酶解水飞蓟粕蛋白制备抗氧化肽方面的研究却鲜有报道。本研究以水飞蓟粕为原料,以抗氧化能力为主要评价指标,通过试验优化水飞蓟粕蛋白的酶解条件,研究酶解物的抗氧化活性,为水飞蓟蛋白资源的高值化利用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水飞蓟种仁:江苏中兴药业有限公司,经过低温加压溶剂萃取技术脱脂,将脱脂水飞蓟粕进行粉碎过 80目筛,制得试验用水飞蓟粕,经测定其蛋白质量分数为 47.23%。中性蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶:无锡杰能科酶制剂公司;胰蛋白酶、木瓜蛋白酶:上海化学试剂公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

加压溶剂萃取装置:江南集团与江苏大学联合研制;FC-160型锤式粉碎机:上海中药机械厂;WFJ7200可见光分光光度计:尤尼柯 (上海)仪器有限公司;ALPHA I-4/2-4型冷冻干燥机:德国CHR IST公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水飞蓟粕蛋白酶解液的制备

按照水飞蓟粕中的蛋白含量配制蛋白质量分数为 2%的悬浮液,40℃水浴浸泡 1 h,85℃水浴加热变性处理 20 min,冷却,调节 pH和温度,加入适量的蛋白酶进行酶解。反应过程中不断加入 0.5 mol/L NaOH溶液,以保持反应体系的 pH恒定。酶解结束后沸水浴 10 min灭酶,3 500 r/min离心 20 min,取上清液定容至适当体积备用。

1.3.2 试验设计

1.3.2.1 蛋白酶的筛选

在各种酶的最适条件下进行酶解试验,筛选出水解水飞蓟粕蛋白所得的酸溶性肽得率和酶解物羟自由基清除率均最大的蛋白酶为最佳用酶。各蛋白酶的作用条件和活力见表 1。

表 1 蛋白酶的作用条件及活力

1.3.2.2 酶解条件优化

根据单因素试验结果,将底物质量分数固定为2%,选取加酶量、pH、酶解温度和时间为 4个考察因素,对每个因素取 3个水平,进行 L9(34)正交试验,因素水平如表 2所示,以酶解物对羟自由基清除率为指标,对酶解条件进行优化。

表 2 正交试验因素水平

1.3.3 酶解物酸溶性肽得率 (TCA-PSI)的测定

按文献 [10]的方法,取酶解液 4 mL,加入 10%TCA溶液 4 mL混合均匀,静置 20 min,在 4 000 r/min下离心 20 min,用双缩脲试剂测定上清液中的肽含量。每个样品测定 3次,取均值。

肽得率(TCA-PSI)=酶解液中酸溶性肽含量/原料中蛋白质含量 ×100%

1.3.4 酶解物抗氧化活性的测定

将在优化条件下得到的水飞蓟粕蛋白酶解上清液冷冻干燥,将粉末配成不同的浓度梯度进行下列抗氧化试验。

1.3.4.1 清除 DPPH自由基能力的测定

参照文献[11],将酶解物配成不同的浓度梯度后分别做为待测样品备用。取 2 mL待测样品于试管中,再加入 2 mL浓度为 0.04 g/L的 DPPH无水乙醇溶液,混合均匀,反应 20 min,3 500 r/min离心分离 10 min,取上清液在 517 nm处测其吸光值为Ai;另取 2 mL待测样品于试管中,分别加入无水乙醇2 mL,反应 20 min,3 500 r/min离心分离 10 min,取上清液在 517 nm处测其吸光值为 Aj;以 2 mL 0.04 g/L DPPH无水乙醇溶液和 2 mL无水乙醇反应做为参比,其吸光值记为 Ao。每个样品测定 3次,取均值。按照下式计算待测样品对DPPH自由基的清除率 K:

K=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%

同时配制不同浓度的维生素 C溶液,按上述方法测定维生素 C对 DPPH自由基的清除率。

1.3.4.2 清除羟自由基 (·OH)能力的测定

参照文献[12],将酶解物用蒸馏水配制成不同浓度梯度,各取 2mL酶解液,依次加入 2 mL 6mmol/L的 FeSO4、2 mL 6 mmol/L H2O2,混匀后静置 10 min,再加入 2 mL 6 mmol/L水杨酸,混匀,静置 30 min,在510 nm处测其吸光值记为 Ai′,当用蒸馏水代替水杨酸时的吸光值记为 Aj′。空白对照组以蒸馏水代替水飞蓟粕酶解液,吸光值记为Ao′。每个样品测定 3次,取均值。按照下式计算水飞蓟粕蛋白酶解物对羟自由基 (·OH)的清除率 Y:

Y=[1-(Ai′-Aj′)/Ao′] ×100%

同时配制不同浓度的维生素 C溶液,按照上述方法测定维生素 C对羟自由基的清除率。

1.3.4.3 还原能力的测定:

参照文献[12],将酶解物用蒸馏水配制成不同浓度梯度,在 2.5 mL pH6.6磷酸缓冲液中加入测试样品 1 mL、1%铁氰化钾 1 mL,混合后于 50℃恒温20 min,再加入 1 mL10%三氯乙酸,然后 3 000 r/min离心分离 10 min,取上层清液加蒸馏水 2.5 mL和0.1%FeCl30.5 mL,混合均匀,静置 10 min后,在700 nm测定吸光值。每个样品测定 3次,取均值。

同时配制不同浓度的维生素 C溶液,按照上述方法测定维生素 C的还原能力。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶的酶解效果

不同蛋白酶的底物特异性及作用位点不同,其酶解产物的功能性也将有所不同。本试验选用了 5种蛋白酶进行酶解试验,考查不同蛋白酶对酶解物TCA-PSI和·OH清除率的影响,以确定合适的蛋白酶,各种酶的酶解条件按表 1进行,蛋白酶的加酶量均为 8 000 U/g,试验结果见表 3。

表 3 不同蛋白酶酶解物的·OH清除率和 TCA-PSI

由表 3可见,中性蛋白酶的·OH清除率和 TCA-PSI最高,其次是木瓜蛋白酶,风味蛋白酶的·OH清除率最低,碱性蛋白酶的 TCA-PSI最低。综合考虑,本试验将中性蛋白酶作为酶解水飞蓟粕蛋白的最佳用酶。

2.2 水飞蓟粕蛋白酶解条件的确定

选用中性蛋白酶,研究不同加酶量、温度、pH和酶解时间对酶解物·OH清除率的影响,按照 1.3.2.2的方法优化了水飞蓟粕蛋白的酶解工艺条件。结果如表 4所示。

表 4 正交试验设计及结果

从表 4中的极差 R分析可知,影响·OH清除率的酶解因素顺序为 C>B>A>D,·OH清除率最高的组合为 A3B3C2D2,即加酶量 14 000 U/g,反应温度55℃,pH 7.0,时间 120 min。在此条件下进行 3次验证试验,水飞蓟粕蛋白酶解物对·OH清除率平均值为 88.57%,比正交试验中各试验值都大,说明得到的最优组合是正确的。

2.3 水飞蓟粕蛋白酶解物抗氧化试验效果

2.3.1 水飞蓟粕蛋白酶解物清除DPPH自由基的效果分析

DPPH是一种有机自由基,DPPH自由基清除率目前被作为评价物质是否具有抗氧化能力的指标之一。由图 1可见,随着水飞蓟粕蛋白酶解物和 VC质量浓度的增大,其清除 DPPH自由基的能力呈增大的趋势,通过对它们质量浓度与清除率之间进行线性回归,可以得到水飞蓟粕蛋白酶解物的 IC50为0.402 g/L,VC的 IC50为 0.004 8 g/L,水飞蓟粕蛋白酶解物的 I C50约为 VC的 83.75倍。尽管水飞蓟粕蛋白酶解物清除DPPH自由基能力不如 VC强,但远高于大米蛋白抗氧化肽[12],表现出较强的清除 DP2 PH自由基的能力。

图 1 水飞蓟粕蛋白酶解物和VC对·DPPH的清除作用

2.3.2 水飞蓟粕蛋白酶解物清除羟自由基 (·OH)的效果分析

图 2 水飞蓟粕蛋白酶解物和VC对·OH的清除作用

由图 2可见,随着水飞蓟粕蛋白酶解物和 VC质量浓度的增大,其对羟基自由基的清除能力呈增大的趋势。通过对它们质量浓度与清除率之间进行线性回归,可以得到水飞蓟粕蛋白酶解物的 IC50为6.659 g/L,VC的 IC50为 0.796 g/L。水飞蓟粕蛋白酶解物的 IC50约为 VC的 8.37倍,其清除羟自由基的能力没有 VC强,但高于酪蛋白[13]、大豆[14]等酶解物对羟自由基的清除力,说明作为一种天然原料,水飞蓟粕蛋白酶解物已具有较强的清除羟自由基的能力。

2.3.3 水飞蓟粕蛋白酶解物的还原能力分析

还原力与抗氧化活性存在相关性,还原力越强,表明被测样品的抗氧化性越好。而反应产物的吸光值越大,表明样品的还原能力越强。从图 3可见,随着水飞蓟粕蛋白酶解物和 VC质量的增大,还原能力都进一步增大,样品质量浓度和还原力之间呈显著的量效关系,水飞蓟粕蛋白酶解物还原力不如 VC强,但与大米蛋白抗氧化肽[12]相比,其已表现出较强的还原能力。

图 3 水飞蓟粕蛋白酶解物和VC的还原能力

3 结论

3.1 采用不同的蛋白酶水解水飞蓟粕蛋白,通过测定其酸溶性肽得率和酶解物清除羟自由基的能力,确定了中性蛋白酶作为水解水飞蓟粕蛋白的最佳用酶。

3.2 通过试验确定中性蛋白酶水解水飞蓟粕蛋白的最佳酶解参数为:底物质量分数 2%,加酶量14 000 U/g,酶解 pH 7.0,酶解温度 55℃,时间 120 min,在此条件下,水飞蓟粕蛋白酶解物对羟自由基清除率为 88.57%。

3.3 水飞蓟粕蛋白酶解物的抗氧化活性试验结果表明,水飞蓟粕蛋白酶解物清除 DPPH自由基和羟自由基的能力及其还原力虽不如 VC强,但与其他天然原料的酶解物比较,其已表现出较强的抗氧化活性。

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Enzymatic Hydrolysis ofMilk ThistleMeal Protein and Antioxidation of Hydrolysates

Zhu Shuyun Dong Ying Zhang Haihui Li Xijing
(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013)

The enzymatic hydrolysis technology ofmilk thistle meal protein and the antioxidation activity of the hydrolysateswere studied.Results show Neutrase is suitable to produce antioxidation active peptide from milk thistle meal protein.The opti mum conditions for the enzymatic hydrolysis were determined through orthogonal tests as fol2 lows:substrate concentration 2%,enzyme dose 14 000 U/g,pH 7.0,temperature 55℃,time 120 min.Under the op2 timum condition,the·OH scavenging rate is 88.57%.Moreover,the result of an antioxidation experiment shows that the milk thistle meal protein hydrolysates have very strong scavenging capabilities for·DPPH and·OH,and their I C50are 0.402 g/L and 6.659 g/L respectively,showing a very strong reducing ability aswell.

milk thistle meal,proteases,enzymolysis,antioxidation activity

TS209

A

1003-0174(2011)02-0068-05

江苏大学高级人才科研启动基金(09JDG027)

2010-03-24

朱淑云,女,1975年出生,讲师,博士,食品科学与工程