酪氨酸蛋白激酶EphA7蛋白在胃癌组织中的表达及与其预后的关系

陈千益 欧敬民 刘颖斌 穆嘉盛 庄鹏远 何晓华

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，在发病机制中已发现许多相关基因高或低表达、变异或缺失等影响着肿瘤的恶性转化、侵袭或转移发挥着重要的作用。通过检测胃癌组织中的相关基因，对临床治疗及评估预后有一定的价值。近年来，酪氨酸蛋白激酶EphA7在肿瘤发生和发展过程中的作用受到越来越多关注，已发现EphA7在许多恶性肿瘤中表达异常，且与肿瘤血管的形成、肿瘤细胞的增殖、侵袭或转移过程有密切关系［1～6］。本研究通过检测酪氨酸蛋白激酶 EphA7蛋白在胃癌组织中的表达，旨在探讨EphA7蛋白表达水平及与其临床病理特征和预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集上海交通大学医学院附属新华医院2003年1月至2008年12月、手术切除并经病理组织学检查证实为胃癌的83例标本作为实验组，术前均未行放疗、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗。其中男性56例，女性27例;年龄43～82岁，平均64岁。83例胃癌中，近端胃癌(U)17例(20.5%)、中段胃癌(M)13例(15.7%)和远端胃癌(L)53例(63.8%)。经病理检查证实高分化腺癌11例(13.3%)，中分化腺癌35例(42.2%)，低分化腺癌29例(34.9%)(其中印戎细胞癌16例、黏液腺癌13例)，未分化腺癌8例(9.6%);Borrmann大体类型:溃疡型11例(13.3%)，乳头状型17例(20.5%)，结节型 23 例(27.7%)，浸润型 32 例(38.5%);浸润深度:T1 4 例(4.8%)(黏膜下层)，T2 21例(25.3%)(肌层6例、浆膜下层15例)，T3 39例(47.0%)(浆膜层)，T4 19 例(22.9%)(累及邻近脏器);淋巴结转移:阴性23例(27.7%)，阳性60例(72.3%);TNM 分期:Ⅰ期 6 例(7.2%)，Ⅱ期 14 例(16.9%)，Ⅲ期 35 例(42.2%)，Ⅳ期 28 例(33.7%)。83例患者中45例行血清CA19-9、癌胚抗原(CEA)检查，其中血清CA19-9阳性率为84.4%(38/45)(分界值34 000 U/L)，血清 CEA阳性率为22.2%(10/45)(分界值19 μg/L)。对照组30例癌旁组织，均经病理检查证实为手术切缘阴性标本。

1.2 试剂与方法

EphA7蛋白鼠抗人单克隆抗体购于福州迈新生物技术有限公司，S-P试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。应用免疫组化法，检测胃癌组织中EphA7表达，将蜡块制成4 μm厚的切片。选取1张行常规HE染色，确定组织学分化程度，检测胃癌组织中EphA7表达的步骤如下:石蜡切片常规脱蜡至水洗;0.01 mol/L pH 6.0枸橼酸盐缓冲液高温高压1.5 min，分别用3%H2O2和非免疫血清阻断内源性过氧化物酶活性，并封闭非特异性结合位点;滴加一抗(EphA7 1∶200稀释)，4℃过夜;生物素标记的二抗37℃孵育30 min;SP复合物37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染3 min，盐酸酒精分化2～3 s，脱水、透明、中性树胶封片。以已知EphA7阳性组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定标准

1.3.1 双人盲法观片 在不知道临床病理资料的情况下，对免疫组化切片进行评估。EphA7抗原定位于细胞质内，胞质内出现棕黄色或棕褐色的颗粒或斑片，癌旁正常组织中也可见EphA7阳性表达，但颜色较浅，呈浅黄色。

1.3.2 光镜下计分标准 按切片中细胞显色有无及深浅计分(A):0分，细胞无显色;1分，胞质显色为浅黄色;2分，胞质显色为棕黄色;3分，胞质显色为棕褐色。按切片中显色细胞的比例计分(B):1分，显色癌细胞占癌细胞总数＜1/3;2分，癌细胞显色比例在1/3～2/3;3分，癌细胞显色比例＞2/3。每例积分=A×B，按积分高低分为:0分为阴性(－);1～2分为弱阳性(+);3～6分为阳性(++);＞6分为强阳性(+++)。

1.4 随访及统计学方法

电话随访或信访。采用SPSS 16.0统计学软件，根据数据类型不同分别进行t检验、Spearman秩相关分析、χ2检验及Fisher精确概率法;生存率的计算采用Kaplan-Meier法，并作Long-Rank检验及 Cox多因素生存分析。

2 结果

2.1 EphA7蛋白在胃癌组织中的表达情况

EphA7蛋白主要表达于肿瘤细胞胞质和血管内皮细胞，呈棕黄色或棕褐色颗粒状或斑片状，染色均一;癌旁组织中也可见EphA7蛋白阳性表达，但颜色普遍较浅，呈浅黄色。83例肿瘤组织中，EphA7蛋白表达阳性68例(81.9%)。对照组30例中EphA7阳性表达7例(23.3%)。EphA7蛋白阳性表达率胃癌组织高于癌旁正常组织(P＜0.05)(表1)。

表1 EphA7蛋白在胃癌组织中的表达情况(例，%)

2.2 EphA7蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

EphA7蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系(表2)。

表2 EphA7蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系(例，%)

2.3 术前血浆肿瘤标志物浓度与EphA7蛋白表达水平的关系

83例胃癌患者中45例行血清CA19-9、CEA检测。EphA7蛋白阳性表达组术前血清CA19-9浓度［(315 500 ±45 700)U/L，n=36］高于阴性表达组［(94 300 ± 27 200)U/L，n=9］(t=2.259，P=0.038)。EphA7蛋白阳性表达组和阴性表达组血清CEA 浓度分别为(34.3 ±6.5)μg/L 和(23.5 ±5.9)μg/L，差异无统计学意义(t=1.433，P=0.155)。E-phA7蛋白表达水平与血清CA19-9、CEA呈正相关性(表3)。

表3 EphA7蛋白表达与血清CA19-9、癌胚抗原(CEA)的关系

2.4 EphA7蛋白表达水平与患者生存期的关系

2.4.1 EphA7蛋白表达阳性组及阴性组的生存情况83例患者中EphA7蛋白表达阳性者68例，阴性者15例。Kaplan-Meier生存分析显示，83例患者1、2、3、5 年生存率分别为 79.2%、66.7%、57.5% 和 20.3%，平均生存期为37.8个月。其中EphA7蛋白表达阴性组1、3、5 年生存率分别为 91.4%、75.6% 和 39.5%，平均生存期为48.3个月;EphA7蛋白表达阳性组1、3、5 年生存率分别为 67.5%、35.2% 和 12.3%，平均生存期为22.7个月。EphA7蛋白表达阳性组与阴性组生存率比较，差异有统计学意义(χ2=10.568，P=0.001)。

2.4.2 EphA7蛋白表达水平对患者预后的影响 单因素分析显示，患者年龄、浸润深度、分化程度、淋巴结转移、TNM分期和EphA7蛋白表达水平与患者预后有关，而性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤大体分型与患者预后无关。对单因素筛选出的显著性变量，纳入Cox模型进行多因素生分析，结果显示EphA7蛋白表达水平、淋巴结转移和TNM分期是胃癌独立的预后因素。

3 讨论

3.1 EphA7蛋白在胃癌中表达及其与临床病理特征的相关性

EphA7是酪氨酸蛋白激酶受体家族(receptor tyrosine kinase，RTK)中的一员，定位于染色体6q16.1靠近断裂点的位置，在人体内分布广泛，参与了细胞生长、分化、胚胎发育及细胞内信号转换等过程中具有相当重要的生理功能［7］。近年研究发现EphA7在许多恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，可能是反映恶性肿瘤进展、生物学行为及预后的重要生物学标志物。Surawska等［8］研究发现，EphA7在肺癌组织中的表达水平较正常肺组织中上升了4.6倍，而Hafner等［9］研究显示结肠癌组织中EphA7表达水平较正常结肠癌组织中下降了5.8倍。本研究结果显示，E-phA7蛋白阳性表达率为81.9%，相应的癌旁组织阳性表达率为23.3%，阳性染色定位于胃癌细胞质和血管内皮细胞中;与癌旁组织比较，EphA7蛋白的表达阳性率在胃癌组织中明显上调。有研究显示，胃癌肿瘤Borrmann大体分型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、切缘癌残留、治疗方式等是影响患者生存率的重要因素［3，10］。本研究显示，EphA7 蛋白表达与肿瘤分化程度呈负相关性，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期呈正相关性。

3.2 EphA7蛋白表达与胃癌侵袭性生长、淋巴结转移的关系

EphA7蛋白在癌组织中的表达水平与恶性肿瘤的侵袭性及预后有关［1～6，8～10］。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，是促进肿瘤转移的重要外部因素，它不仅为肿瘤提供充足的营养，而且为转移的肿瘤细胞提供了通道。大量的生物化学和遗传学证据提示了Eph/Ephrin信号传导通道在血管发生、发育过程中起着关键作用［11］。本研究中，EphA7蛋白高表达于肿瘤细胞和血管内皮细胞中，同时显示与胃癌淋巴结转移呈正相关。由此可见，EphA7蛋白主要影响胃癌的浸润及转移，通过检测胃癌细胞EphA7蛋白表达水平，可初步判断胃癌生物学行为的恶性程度。

3.3 EphA7蛋白表达水平与术前血浆肿瘤标志物的相关性

CA19-9是诊断和检测消化道恶性肿瘤的有效肿瘤标志物之一，而且CA19-9水平进行性升高在临床症状出现之前，可作为术后判断肿瘤复发的指标［12］。目前，尚未见EphA7蛋白表达与血清CA19-9关系的详细报道。本研究显示，EphA7蛋白阳性表达组术前血清CA19-9浓度高于阴性表达组，血清CEA浓度也高于阴性表达组，但两组间差异无统计学意义;EphA7蛋白表达与血清CA19-9、CEA浓度呈正相关性。

3.4 EphA7蛋白表达水平与胃癌预后的相关性

EphA7在不同肿瘤中发挥的作用有可能不同，而这种可能与EphA7能和不同的Ephrin配体结合后产生的双向信号调节有关，提示EphA7可能主要作为1种致癌蛋白参与了肿瘤细胞的恶性转化过程，参与细胞周期调节及参与血管形成作用［1，8～11］。而肿瘤组织中高水平的EphA7蛋白必然导致肿瘤细胞凋亡的抑制、细胞周期的改变，引起肿瘤细胞增殖过旺，加之E-phA7蛋白高表达引起肿瘤组织新生血管增多，血液供应丰富，更加引起肿瘤细胞增殖过旺，这样就导致肿瘤形成［3，6］。已形成的肿瘤组织因EphA7蛋白进一步表达，使该肿瘤细胞不易凋亡，有恶性繁殖的条件及倾向，故其临床预后较差［13］。研究表明，结肠癌中 E-phA7低表达与患者性别、癌细胞分化程度、肿瘤发生部位等有关，而与患者年龄无关［4，9］。而胃癌中 E-phA7高表达与患者年龄、肿瘤分期有关，术后5年生存率有显著差异，提示EphA7蛋白表达可以影响肿瘤生物学行为，可使其更易发生局部与血行复发转移等恶性行为，是预后不良的指征［3，10，11，13，14］。本组资料显示，EphA7蛋白表达是胃癌患者预后差的标志，EphA7蛋白表达阳性组 1、3、5年生存率分别为67.5%、35.2%和12.3%，显著低于阴性组 1、3、5 年生存率;多因素分析显示，EphA7蛋白表达水平、淋巴结转移和TNM分期为胃癌根治术后独立的预后因素，EphA7蛋白表达阳性提示预后不良。

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