活血颗粒质量标准研究

张志勇，李艳丽，高翔宇，刘恩荔 (山西医科大学药学院中药学教研室，太原 03000;山西生物应用职业技术学院生物制药工程系)

活血颗粒是由柴胡、白芷、白芍、穿山甲、红花等17味药材组成。本品具有活血化瘀、软坚散结的功效，是治疗乳癖病的常用处方。原标准仅收录了当归的薄层色谱鉴别，为了有效地控制药品内在质量，确保用药安全有效，本文对其质量标准进行了提高。根据医疗机构制剂注册批件的要求需增加药味总数1/3以上的薄层色谱鉴别。本文增加了白芍、柴胡、白芷、穿山甲的薄层鉴别及芍药苷的含量测定项，一定程度上提高完善活血颗粒的质量标准。

1 材料、试剂与仪器

1.1 对照品及对照药材 当归对照药材(120927－200512)、芍药苷对照品(含量测定用，110736－200628)、熊果酸对照品(鉴别用，0742－200010)、红花对照药材(120907－200609)、白芷对照药材(110717－200204)、柴胡对照药材(0992－200102)、皂角刺对照药材(121210－200502)、郁金对照药材(120949－200504)、穿山甲对照药材(121027－200403)均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 试剂 硅胶G;所用试剂均为分析纯。水为去离子水。

1.3 仪器 大连伊利特高效液相色谱仪;UV200Ⅱ型可见紫外分光光度计。

2 方法与结果

2.1 白芍的薄层鉴别 供试品溶液的制备:取本品内容物10 g，加乙醇30 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇提取液，置水浴上浓缩至1 ml，加适量中性氧化铝，拌匀，干燥，加在中性氧化铝柱(100目，5 g，内径1 cm)上，用甲醇60 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备:另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

阴性溶液的制备:按比例称取除白芍外的其他药味，同法制成阴性溶液。

照薄层色谱法［1］(附录Ⅵ B)试验，吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

结果:供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性无干扰(见图1)。

图1 白芍的薄层鉴别Fig 1 Thin layer chromatogram of Radix Paeoniae Alba

2.2 穿山甲的薄层鉴别 供试品溶液的制备:取本品内容物10 g，加三氯甲烷30 ml，加热回流4 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备:取穿山甲对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。

阴性溶液的制备:按比例称取除穿山甲外的其他药味，同法制成阴性溶液。

照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－丙酮(20∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐－硫酸(9∶1)的混合液，在80℃加热数分钟，置日光下检视。

供试品色谱中，在对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰(见图2)。

图2 穿山甲的薄层鉴别Fig 2 Thin layer chromatogram of Semen Vaccariae

2.3 柴胡的薄层鉴别 供试品溶液的制备:取本品内容物10 g，加甲醇35 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加2%的氢氧化钠溶液10 ml，加热回流30 min，放冷，加正丁醇提取3次，每次20 ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液［2］。

对照药材溶液的制备:取柴胡对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。

阴性溶液的制备:按比例称取除柴胡外的其他药味，同法制成阴性溶液。

照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水(15∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。日光下检视。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，有相同颜色的斑点，阴性无干扰(见图3)。

图3 柴胡的薄层鉴别Fig 3 Thin layer chromatogram of Radix Bupleuri

2.4 白芷的薄层鉴别 供试品溶液的制备:取本品内容物10 g，加乙醚30 ml，低温回流1 h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备:另取白芷对照药材0.5 g同法制成对照药材溶液。

阴性溶液的制备:按比例称取除白芷外的其他药味，同法制成阴性溶液。

照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述溶液各8 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30－60℃)－乙醚(3∶2)为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上出现对应斑点，阴性无干扰(见图4)。

图4 白芷的薄层鉴别Fig 4 Thin layer chromatogram of Radixngelicae Dahuricae

2.5 白芍中芍药苷的含量测定

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:采用迪马Kromasil ODS C18(250 mm×4.6 mm)。能达基线分离;检测波长:以对照品溶液进行紫外全程扫描，可知其在230 nm处有最大吸收，参考文献，以230 nm作为检测波长;流动相:以甲醇－水(29∶71)作为流动相，主峰保留时间适宜，主峰与其他色谱峰分离度大于1.5。理论塔板数按芍药苷计不得少于3 000［3－6］。

2.5.2 溶液的制备 取重量差异项下的本品，研细，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇25 ml，称定重量，超声处理(功率240 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备:取芍药苷按供试品溶液的制备方法制成对照品溶液。

阴性溶液的制备:取处方除白芍的全部药味，按成品工艺及供试品溶液的制备方法制备空白对照品溶液。

测定法:分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.5.3 专属性试验 按上述方法将供试品、对照品、阴性对照品进行测定。结果:在芍药苷处无干扰(见图5)。

图5 芍药苷HPLC图谱Fig 5 High performance liquid chromatogram of peoniflorin

2.5.4 线性关系及线性范围考察 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成61.75 μg/ml的溶液，分别精密量取1，2，3，3，5 ml至 10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别进样20 μl，测定。以峰面积积分值为纵坐标(y)，以芍药苷进样量为横坐标(x)，绘制标准曲线，得芍药苷含量测定线性关系图。回归方程为y=540.7x+25.933，相关系数r=0.999 9。结果表明，芍药苷对照品进样量在 0.123 5－0.617 5 μg范围内与峰面积值呈现良好线性关系。

2.5.5 精密度考察 取同一批号(110736－200628)的供试品，按供试品处理方法，制得供试品溶液。精密吸取20 μl，注入液相色谱仪，依法连续进样6次，RSD=1.36%。结果表明，精密度良好。

2.5.6 重复性试验 取同一批号的供试品，按供试品处理方法，共6份，制得供试品溶液，依法测定，计算各样品中芍药苷的含量。结果表明:该方法的重复性良好。

2.5.7 回收率试验 取已知芍药苷含量的供试品，研细，混匀，取约2.5 g，精密称定，共6份，分别精密加入芍药苷对照品，按照供试品溶液的制备方法制备，依法测定，并计算各样品中芍药苷的含量，并计算回收率，见表1。结果表明:该法具有良好的回收率。

表1 回收率测定结果Tab 1 Results of recovery test

2.5.8 白芍药材的测定 取本品粉末约0.4 g，精密称定，分别按照供试品溶液制备方法制备，依法测定，并计算各样品中芍药苷的含量，结果见表2。

表2 白芍药材中芍药苷含量测定结果Tab 2 Content of peoniflorin of Radix Paeoniae Alba

2.5.9 样品测定 按正文拟定含量测定方法，分别采用3批样品进行测定，结果见表3。

表3 3批样品测定结果 (n=3)Tab 3 Content of peoniflorin of the samples (n=3)

参照3批样品的含量测定结果，求得平均含量为0.65 mg/袋。以平均含量的80%作为样品含量测定的限度，即本品含白芍按芍药苷计，每袋不得少于 0.52 mg。

3 讨论

3.1 本品中白芍、柴胡、白芷、穿山甲等均为主要药味，方法学研究结果表明，采用薄层色谱法对白芍、柴胡、白芷、穿山甲等进行定性鉴别，薄层色谱斑点清晰、专属性强。在进行TLC鉴别研究时，增加了相应药材的供试品溶液，以求保证本品质量的同时，监控投料药材的质量，可作为中成药TLC鉴别的一种思路，从源头控制产品质量。

3.2 用HPLC法测定芍药苷含量，试验比较了多种比例的流动相，以甲醇－水(29∶71)为流动相，分离效果较佳，保留时间适宜，分离度大于1.5。该方法简便可靠，精密度高，分离度好，可用于活血颗粒的质量控制。

［1］ 中化人民共和国药典委员会.中国药典(一部)［S］.2010版，北京:中国医药科技出版社，2010:附录Ⅵ.

［2］ 赖克道，刘元，文志云，等.薄层色谱法定性鉴别小柴胡颗粒中的柴胡、甘草［J］.广西医学，2009，31(6):886－887.

［3］ 张海龙，崔永霞，王淑美，等.高效液相色谱法测定脑心通胶囊中芍药苷的含量［J］.中医学报，2010，25(1):118－119.

［4］ 李春实，韩映晨，汝秋明.益脑复健胶囊的质量标准［J］.中国药师，2010，4(12):1738－1740.

［5］ 陈磊垚.夏菊滴鼻液质量标准的研究［J］.现代中西医结合杂志，2009，18(11):1288－1289.

［6］ 康阿龙，张苏蘅，张娴.乳癖克胶囊质量标准的研究［J］.解放军药学学报，2011，27(1):47－49.