葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌纸及抗菌性研究

虢 杰，杨仁党，*，李雪云

（1.华南理工大学制浆造纸国家重点实验室，广东广州510640；2.广东省造纸技术与装备公共实验室，广东广州510640）

葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌纸及抗菌性研究

虢 杰1，2，杨仁党1，2，*，李雪云1，2

（1.华南理工大学制浆造纸国家重点实验室，广东广州510640；2.广东省造纸技术与装备公共实验室，广东广州510640）

葡萄糖氧化酶是氧化葡萄糖的专一催化酶，具有脱氧、杀菌的功能。通过定性和定量抗菌实验方法研究了葡萄糖/葡萄糖氧化酶体系在以淀粉作为载体和不混合淀粉时施涂于纸张表面的抗菌效果。定性抗菌实验表明，葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌纸具有良好的抗菌效果。而定量检测结果表明，pH等于5.5时，35℃反应10min，不添加淀粉时，葡萄糖氧化酶最小的抑菌浓度约为70U/m2，葡萄糖足量时，酶用量越高，抗菌率越好；添加0.7g/m2淀粉后，最小抑菌浓度提高到约650U/m2。淀粉对葡萄糖/葡萄糖氧化酶体系的抗菌效果有较大影响，主要原因是淀粉能够促进细菌的繁殖。

葡萄糖/葡萄糖氧化酶，抗菌纸，抗菌性，定性与定量抗菌实验

抗菌纸是各种具有抑制危害纸品微生物能力的功能性纸张的统称［1］，其抗菌效果来源于抗菌剂。一般来讲，抗菌剂在低浓度时只有抑菌作用，而浓度增大或作用时间延长时，可起到杀菌作用［2］。抗菌纸用于食品包装时，可以使被包装的食品、果蔬等延长保质期而不变质。也就是说，食品用抗菌包装纸基本功能是：防止微生物的污染和昆虫的侵入，保护商品在生产和销售过程中不变质［3-4］。目前，超市里的生鲜食品，为了保持新鲜，延迟变质时间，通常添加一些化学物质或采用特殊的包装技术来延长货架期，如添加二氧化氯做为保鲜剂，采用真空预处理和气调包装技术都能达到较好的延长货架期的目的［5-9］。但这些常规方法也存在不足的地方，有些生产成本较高，有些保鲜效果一般，货架存放时间较短，影响产品的经济性。葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地将β-D-葡萄糖（Glucose）氧化成为葡萄糖酸和过氧化氢，在食品保鲜、医药检测等许多方面得到广泛的应用［10-12］，其化学反应机理如下：

此外，Mattila Tiina和M.Sandholm［13］的研究结果显示，葡萄糖/葡萄糖氧化酶的组合具有明显的细菌生长抑制作用。尽管在生鲜产品如牛肉、鸡等表面喷洒葡萄糖氧化酶能起到抑菌、抗菌效果，延长产品的货架时间，但工艺要求严格，质量难以保证。本文将葡萄糖/葡萄糖氧化酶施涂于纸张表面，并探讨其抗菌性，为开发生鲜产品抗菌保鲜包装纸提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

β-D-葡萄糖（Glucose） 分析纯；葡萄糖氧化酶（GOD） 活性245U/mg，sigma公司产品，购自广州杰顺生物科技有限公司；玉米原淀粉 水分90%；实验菌 大肠杆菌（Enterobacter cloacae）；培养基0.5%氯化钠，0.5%牛肉膏，1.5%蛋白胨，1%琼脂粉加去离子水配制而成；肉汤培养基 将所有成分溶于去离子水中，定容至1000mL，调节pH为7.2～7.4，121℃下高压灭菌20min取出，置于无菌室保存待用；琼脂肉汤培养基 步骤同上，在无菌室中操作，将灭完菌后的琼脂肉汤培养基溶液倒入灭菌平皿制成平皿培养基，培养基冷却凝固后翻转放置，1d后观察是否有杂菌，如果没有则可放于无菌室待用。

1.2 实验方法

1.2.1 抗菌纸制备 将去离子水配好的Glucose溶液、GOD溶液和糊化淀粉溶液在pH5.5和35℃恒温下反应预定时间后，全部施涂于直径9cm的过滤纸表面上，用刮棒刮平，使液体均匀吸收且不流出来，放入干净托盘中，在30℃真空干燥箱干燥一夜。

1.2.2 菌液制备 采用美国AATCC 100两步法［14］在37℃下活化菌种，制取所需浓度的菌液。

1.2.3 细菌培养与检测

1.2.3.1 抑菌环实验法定性检测［15-16］用接种环将大肠杆菌菌液接种到制备好的培养基上并涂匀，覆盖上事先剪好的圆形纸片，将培养皿倒置在37℃的培养箱中培养19h取出，根据抑菌环的大小来测定抗菌性能。

1.2.3.2 吸收法定量检测［14，16］将抗菌纸和对照样纸片放入三角烧瓶中后吸收定量的菌液，37℃下恒温培养20±2h，或者不培养固定时间直接用肉汤培养基溶液把纸片上的细菌洗涤下来，稀释适当浓度后接种到平皿培养基上，然后倒置在37℃的培养箱中培养19h取出，进行计数。计算公式为：

细菌减少百分率（抗菌率）（%）=（“0”接触时间试样上细菌数-定期培养试样上细菌数）/“0”接触时间试样上细菌数×100%

或细菌减少百分率（%）=（“0”接触时间对照样上细菌数-定期培养试样上细菌数）/“0”接触时间对照样上细菌数×100%

或细菌减少百分率（%）=［（“0”接触时间试样上细菌数+“0”接触时间对照样上细菌数）/2-定期培养试样上细菌数］/［（“0”接触时间试样上细菌数+“0”接触时间对照样上细菌数）/2〛×100%

如果“0”接触时间试样上的细菌数和“0”接触时间对照样上的细菌数差别较大时，取较大值；如果两者差别不大时，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 抑菌环法定性抗菌效果

取葡萄糖用量3500、21000μmol/m2绝干纸，葡萄糖氧化酶用量3500、7000、21000U/m2（如表1中实验号1～6所示），pH 5.5，35℃下反应10min后施涂于滤纸上，用抑菌环法定性检测抗菌效果。

表1 不同比例葡萄糖/GOD/淀粉组合的抗菌效果

从表1看出，滤纸面积3.14cm2，1、3、5号抑菌环面积分别为7.61、4.90、2.17cm2，抗菌、抑菌效果很明显，其葡萄糖用量为3.78g/m2，葡萄糖氧化酶用量分别为21000、7000、3500U/m2。因为葡萄糖氧化酶作为催化剂，其用量决定催化能力，从而影响生成产物量和抗菌效果；而葡萄糖用量0.63g/m2时，无论葡萄糖氧化酶用量是3500U/m2或是21000U/m2，都没有明显的抑菌环出现。

同样取葡萄糖用量21000μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量如表1中实验号7～9所示，淀粉用量0.7g/m2。与1、3、5号对比，相同的葡萄糖和葡萄糖氧化酶用量时，7、8、9号的抑菌环面积都相对较小，抗菌效果不如未添加淀粉的明显，加入淀粉载体后大大降低了抗菌效果。

2.2 葡萄糖/葡萄糖氧化酶的抗菌性定量分析

为了对葡萄糖/葡萄糖氧化酶的抗菌效果进行更准确的数据分析，采用定量吸收法检测。首先优化葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应时间，实验中取葡萄糖用量350μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量350U/m2，反应时间和抗菌率见表2。催化反应1min，抗菌纸的抗菌率为3.4%，反应5min为23.2%，比反应1min的效果有很大提高，这说明1min的反应很不完全；反应10min时抗菌率也比反应5min的效果有明显提高。对于以下实验，反应时间选择10min。

表2 不同GOD/葡萄糖催化反应时间的抗菌率

2.2.1 葡萄糖与抗菌率的关系 图1表示葡萄糖氧化酶用量350U/m2时，葡萄糖用量与抗菌率的关系。抗菌率随着葡萄糖用量的增加而提高，葡萄糖用量低于150μmol/m2，对细菌没有抗菌效果，葡萄糖用量840μmol/m2，抗菌率达到80%。葡萄糖是反应物，其用量直接影响生成物的量。继续增加葡萄糖用量，抗菌率没有明显提高。由于酶用量的限制，即使继续增加葡萄糖用量，抗菌率也基本保持不变。一定的酶浓度时，葡萄糖浓度在一定范围内，对抗菌率有很大的影响。

图1 葡萄糖用量对抗菌效果的影响

2.2.2 葡萄糖氧化酶与抗菌率的关系 用固定的过量葡萄糖，检测葡萄糖氧化酶对抗菌效果的影响（图2）。葡萄糖用量2800μmol/m2，葡萄糖氧化酶用量很低时，抗菌率随着葡萄糖氧化酶用量的增加快速上升。当葡萄糖氧化酶浓度大于70U/m2时，检测结果显示大肠杆菌的生长受到抑制，在抗菌纸上培养20h后，大肠杆菌的数目比未培养20h的对照样上的细菌数目减少，此时的酶浓度可以认为是最小抑菌浓度（MIC）。当酶用量达到350U/m2，抗菌率达到84%，酶用量550U/m2时，抗菌率91%，之后抗菌率虽然随着酶用量的增加继续提高，但增速与前面的相比明显减慢。

图2 葡萄糖氧化酶用量对抗菌效果的影响

2.2.3 淀粉对抗菌效果的影响 淀粉是目前常用的表面施胶剂，可以利用淀粉作为载体把葡萄糖/葡萄糖氧化酶施涂到纸基表面。实验中，葡萄糖用量与葡萄糖氧化酶用量比为2∶1，溶液在相同的温度和pH条件下反应10min后，与糊化淀粉溶液混合均匀施涂到滤纸表面，抗菌率如图3所示。

葡萄糖氧化酶用量700U/m2时，未添加淀粉的抗菌纸抗菌率为95%，添加0.7g/m2淀粉后抗菌纸的抗菌率只有2%，淀粉施胶剂对葡萄糖/葡萄糖氧化酶体系的抗菌性能有很大影响。最小抑菌浓度也有明显变化，未添加淀粉时为70U/m2，添加0.7g/m2淀粉时提高到650U/m2。从曲线可以看出，用淀粉作为载体，继续增加葡萄糖和葡萄糖氧化酶用量可以提高抗菌效果。但是，由于淀粉是细菌生长的营养物，会促进细菌的生产，从而会影响抗菌纸的抗菌效果，这与抑菌环定性分析结果相符。

图3 淀粉用量对抗菌效果的影响

3 结论

定性和定量抗菌实验表明，葡萄糖/葡萄糖氧化酶抗菌纸具有良好的抗菌性能。当pH为5.5，35℃下催化反应10min时，反应较充分，抗菌效果与葡萄糖、葡萄糖氧化酶和淀粉施载体用量有关。

葡萄糖氧化酶浓度一定时，葡萄糖浓度在一定范围内，对抗菌率有很大的影响，超过此范围，抗菌率基本保持不变。葡萄糖用量充分时，抗菌率随着葡萄糖氧化酶用量的增加而提高，酶用量550U/m2时，无淀粉施涂的抗菌纸抗菌率可超过90%。

不添加淀粉时，葡萄糖氧化酶最小抑菌浓度约为70U/m2；用0.7g/m2淀粉施胶后，最小抑菌浓度提高到约650U/m2，淀粉对葡萄糖/葡萄糖氧化酶体系的抗菌效果有较大的影响。添加淀粉后，葡萄糖/葡萄糖氧化酶体系的抗菌效果变差，主要原因是淀粉促进了细菌的生长，因此今后可以选用其它的不会促进细菌繁殖的合成化合物如聚乙烯醇作为载体等进行研究。

［1］周亮.抗菌纸的研究进展［J］.包装工程，2005，26（5）：103-108.

［2］贾冬舒，杨飞华，童忠良.纳米抗菌材料制备方法与应用研究进展［J］.建筑装饰材料世界，2003（Z1）：59-61.

［3］陈德卫，梁超雄.包装纸的发展前景与发展对策［J］.造纸科学与技术，2005，24（1）：62-65.

［4］向贤伟.食品包装技术［M］.长沙：国防科技大学出版社，2002：1-4.

［5］周大成.保鲜纸［P］.中国专利：88206674，1989-11-29.

［6］邓东泉，孙恒，肖尤明，等.真空预冷技术的现状和发展前景［J］.食品工业科学与技术，2002，23（7）：73-75.

［7］王如林，夏睿.真空预冷技术的开发和应用［J］.广州食品工业科技，2002，15（1）：54-55.

［8］叙文达，程裕东，岑伟平，等.食品软包装材料与技术［M］.北京：机械工业出版社，2003：103-107，209-211.

［9］黄壮霞，张愁，朱丹实，等.MAP结合真空预处理延长鲜牛肉货架期［J］.食品与生物技术学报，2005，24（3）：22-26.

［10］张树政.酶制剂工业（下册）［M］.第二版.北京：科学出版社，1998：671-698.

［11］谭斌.酶在食品保鲜中的应用［J］.食品科技，1998（5）：32-33.

［12］黄惠芝，黄春波.葡萄糖氧化酶在啤酒生产中的应用研究［J］.食品科学，1998，19（11）：21-24.

［13］Tiina Mattila，Sandholm M.Antibacterial effect of the glucose oxidase-glucose system on food-poisoning organisms［J］.International Journal of Food Microbiology，1989（8）：165-174.

［14］ AATCC100：1999.Antibacterial Finishes on Textile Materials：Assessment of［S］.

［15］中华人民共和国卫生部消毒技术规范（2002）［S］.

［16］JIS L 1902：2002.Testing for antibacterial activity and efficacy on tetile product［S］.

Study on glucose/glucose oxidase antibacterial paper and its antimicrobial property

GUO Jie1，2，YANG Ren-dang1，2，*，LI Xue-yun1，2
（1.State Key Laboratory of Pulpamp;Papermaking Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Guangdong Public Laboratory of Process Technology and Equipment Team，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Glucose oxidase is specific for β-D-glucose，and of oxygen removal and antibacterial functions. Antimicrobial effects of paper coated via glucose/glucose oxidase with/without starch were investigated by means of qualitative and quantitative assay.Qualitative assay phenomenon showed that glucose/enzyme paper was capable of inhibiting bacteria growth to betterextent.The experimentalresults from quantitative assay demonstrated that minimal inhibition concentration（MlC）was about 70U per square meter under the conditions of pH 5.5，35 centigrade，10 minutes reaction time，and without starch.And that if the dosage level of enzyme rises with saturation of glucose，the germproof effects could be more remarkable.However，MlC was up to round 650U per square meter with 0.7 gram per square meter starch addition.The starch hereby imposed a significant negative effect on the antibacterial properties of glucose/enzyme paper.This owes to starch nutriment contributing to bacteria growth.

glucose/glucose oxidase；antibacterial paper；antimicrobial property；qualitative and quantitative assay

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0124-04

2009-12-25 *通讯联系人

虢杰（1985-），男，硕士研究生，主要从事造纸技术与特种纸方面的研究。